细胞培养工程 05 细胞培养生物反应器(I)

• 动物细胞
– 尺度大，无细胞壁，抗剪切力能力较差 – 生长速度慢，溶解氧（DO）需求较低 • 通气量：较低 • 搅拌：能量输入较低，主体混合（搅拌桨）
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细胞培养生物反应器：1980-90s（1）
• 微生物深层发酵技术已经相当成熟 – 搅拌式生物反应器设计和性能 – 控制与配套设施 • 细胞培养从有血清贴壁到无血清悬浮的过渡 • 能否悬浮生长（杂交瘤细胞例外） • 能否无血清生长 • 能否耐受反应器内搅拌剪切力 • 能否耐受通氧（气泡） • 能否提高细胞密度，以提高生产效率
FBS(2.5%)
FBS(1.0%)
FBS(0.5%)
FBS(0.25%)
FBS(0%)
90
Viable cells (10 /ml)
5
10
p p F F p F
Viability (%)
p
80
70
F
60 1
viable cells viability
0 50 100 200 300 400 500 600 700 800 900 100011001200130014001500
A large-sale chromatography system in a Lonza Biologics’ Singapore plant （2008.08）
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2.细胞悬浮培养模式
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生产细胞株
• 生产细胞株合成蛋白质产物的能力主要取决于 – 表达载体设计 – 表达载体在宿主细胞染色体上的整合位点是 否位于转录活跃区（低于染色体 3%） – 克隆筛选 • 传统：Limiting Dilution • 现代方法：FACS 或其它专门仪器等 – 在没有选择压力（如 MTX 对 DHFR 系统） 存在的条件下，细胞株必须能够生长足够代 时且保持稳定的产物分泌能力
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生物反应器的主要功能（1）
• 为细胞生长提供一个与外界隔离的无菌环境 – 清洗（CIP） – 高温灭菌（SIP） • 混合搅拌功能 – 克服细胞重力沉降，并使其分布均匀 – 降低气泡尺度，延长气泡停留时间，提高氧 传质效率 – 保证营养物和代谢产物分布均匀 – 避免温度、酸碱度局部过高（温度与 pH 控 制启动）
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工艺过程开发与优化概括（2）
• 培养基优化 – 在渗透压允许范围内，平衡底物比例，以 • 提高活细胞密度 • 提高产物浓度 • 减少代谢副产物生成 – 采用高通量培养体系和统计学实验设计 （DoE），以提高筛选效率，降低工作量 和成本
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工艺过程开发与优化概括（3）
t (hours)
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Cell Weaning 20040221
％） Viability（
Viable Cells Viability
70
5
抗体分泌 CHO 细胞的驯化
细胞初始状态：贴壁，10% 牛血清 第一阶段：悬浮驯化，10% 牛血清 第二阶段：无蛋白培养驯化
100
FBS(5%)
培养基 细胞 截 留 装 置 培养基 产物回收
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产物回收
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灌流培养（Perfusion culture）
• 主要细胞截留装置 – 中空纤维系统 – 内置钢丝网 – 细胞沉降倾斜扁管 • 活细胞沉降速度 高于死细胞 • 活细胞沉降至底 板、回流，死细 胞随培养基溢出

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连续培养（Continuous culture）
• 培养液接种细胞后，在合适时间启动培养基连续添加， 并同时连续收获培养液，细胞密度、底物浓度和产物浓 度处于稳态； • 缺乏竞争优势（与灌流相比较），目前不常用
加料 产物 底物 收获 细胞
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流加培养（Fed-batch culture）
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微生物与动物细胞的主要差异
• 尺度 • 细胞壁 • 生长速度
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Molecular Cell Biology (5th ed.) by Lodish et 5al.
微生物与动物细胞的主要差异
• 微生物细胞
– 尺度小，有细胞壁，抗剪切力能力较强 – 生长速度快，溶解氧（DO）需求较高 • 通气量：较高甚至很高 • 搅拌：能量输入较高，主体混合与微混合（搅拌桨）
– 现已有多种酶电极分析装置，可以提供在线检测，并可 以根据设定值添加以维持某种底物的浓度恒定，但购置 与使用成本很高。
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支原体（Mycoplasma）
支原体，又称霉形体，1898 年 发现，为目前发现的最小、最简 单的原核生物，大小介于细菌和 病毒之间。
支原体细胞中唯一可见的细胞器 是核糖体。没有细胞壁，多数成 球形，具有较大的可变性。 支原体可以在特殊的培养基上接 种生长，进行临床鉴定。
• 剪切力较小，90 年代曾用于大规模培养 • 操作灵活性较差，现不多用
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搅拌式生物反应器 – 主流
• 操作灵活，可批次、流加或灌流，普遍使用
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A 20,000-liter cell culture bioreactor system is installed in a Lonza Biologics plant in Singapore.
• 反应器操作模式 – 批次培养：培养基优化，生长培养基优化 – 流加培养： • 补料培养基优化 • 延长高密度培养时间
P=
ò q C (t ) dt
p v 0
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t
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杂交瘤细胞无血清培养驯化过程
100 100 90 80
Viable Cells (10 /ml)
60 10 50 40 30 20 10 1 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 0 1000 1100
• 先将一定量培养液加入反应器，然后接种细胞。随着营 养物质的消耗，启动新鲜培养基或成分添加机制，使细 胞能在较长时间内维持较高密度生长和代谢； • 工业生产最主要的培养方式。
加料 产物 底物 细胞
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灌流培养（Perfusion culture）
• 培养液接种细胞后，在合适时间启动培养基连续添加， 并同时连续收获培养液，经细胞截留装置，截留细胞回 流到反应器； • 高细胞密度培养，目前尚有采用，。
动物细胞培养 生物反应器
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1. 生物反应器概述
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细胞培养生物反应器
• 基因工程技术出现之前 • 低血清贴壁培养动物细胞，用于病毒疫苗生产
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微生物发酵简史
• 1920s：酒精、甘油和丙酮等（厌氧发酵） • 1940s：青霉素/抗生素、有机酸、微生素、激素等 （无菌技术与深层发酵 - 通气/搅拌) • 1950s：谷氨酸/氨基酸、核苷酸、有机酸和部分抗生素 （代谢控制与菌种人工诱变） • 1970s：定向育种、基因工程蛋白质表达
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细胞培养生物反应器：1980-90s（2）
• 经过业内十余年的不懈努力，搅拌式生物反应器已 经成为大规模细胞培养普遍采用的设备 • 可以悬浮生长 • 可以无血清甚至无蛋白生长 • 经过改进搅拌桨设计，可以耐受搅拌剪切力 • 在提供保护剂的条件下，可以耐受通氧 • 通过培养基合理设计，可以提高细胞密度 • 尽管大规模生产不采用，但是新颖生物反应器研发 为干细胞、组织工程和新型技术奠定了基础 • 中空纤维、水凝胶固定化、微胶囊等 • 允许灌流操作（抗体浓度达到 25 g/L）
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生物反应器的主要功能（2）
• 通氧，避免培养基溶解氧（DO）过低 • 控制 – 对环境参数（搅拌桨转速、细胞浓度、温度、 DO、pH 等）进行实时监控和记录，并维持在 较窄的设定范围之内 – 出液（连续培养），补料（流加培养）
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气升式生物反应器（Airlift Bioreactor）
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• pH
– – – –
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生物反应器 – 过程参数检测与控制
• 控制理论：PID 反馈控制 – Proportional：矫正量 – Integral：矫正归位 – Differential：矫正速度
来自百度文库
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生物反应器 – 过程参数检测与控制
• DO
– 甘汞电极
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3.生物反应器控制
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生物反应器 – 过程参数检测与控制
• 溶解氧（DO）
– – – – 维持细胞生长与代谢 设定浓度适中 始终处于被消耗状态 矫正措施：通氧（顶部/底部） 乳酸形成（葡萄糖/谷氨酰胺代谢） 铵离子形成（谷氨酰胺/氨基酸代谢） CO2 形成 矫正措施：在 DO 或 pH 偏离设定值（范围）时自动启 动通气或泵入所需溶液
• 受溶液（化学成分）环 境干扰比较大 • 输出信号：电压
• pH电极
– 耐高温灭菌 – 性能稳定
– 极谱氧电极
• 电极不与培养基液体直 接接触，由一层膜隔离 • 氧分子跨膜扩散速率与 DO 浓度成正比 • 输出信号：电流
• 温度电极
– 热电偶 – 性能稳定
– 耐高温灭菌 – 性能稳定
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生物反应器 – 过程参数检测与控制
• 生物反应器控制的重要性
– 为细胞生长提供一个稳定的生理环境 – DO、pH、温度在线自动控制相对比较容易实现 – 主要底物和代谢副产物通常在无菌取样后分析
• • • • • 葡萄糖 乳酸 谷氨酰胺 铵离子 氨基酸 葡萄糖氧化酶 乳酸脱氢酶 谷氨酸脱氢酶/心肌磺酶/天冬酰胺酶 谷氨酸脱氢酶 HPLC
http://bbs.biogo.net/read.php?tid=164679
形态 • 大小为 0.2 - 0.3 µ m，无细胞壁，形态呈现多形性，可通过滤膜； • Giemsa 染色法呈淡紫色（革兰氏染色不易着色）； • 细胞膜胆固醇含量丰富，约占 36%。 基因组 • 一个环状双链 DNA，分子量小（仅有大肠杆菌的1/5），合成与代谢 能力很有限。 生长特性 • 繁殖方式多样，二分裂繁殖为主，还有断裂、分枝、出芽等方式； • 支原体细胞分裂与其 DNA 复制不同步，可形成多核长丝体； • 体外培养需 10 - 20% 人或动物血清（胆固醇）； • 最适 pH 7.8 - 8.0 ，一般低于 7.0 则死亡（解脲脲原体，pH 6.0 - 6.5）； • 大多数兼性厌氧，生长缓慢，在琼脂含量较少的固体培养基上孵育 2 - 3 天出现典型的 “荷包蛋样” 菌落（圆形，直径 10 - 16 µ m），核 心部分较厚，向下长入培养基，周边为一层薄的透明颗粒区； • 支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜或培养细胞中生长；
t (hours)
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批次培养（间歇培养）
• 培养液接种细胞后，培养过程中不再添加培养基， 细胞生长消耗营养并形成产物，在营养消耗完后 终结培养、回收产物 • 过程开发优化最基本培养方式
底物
细胞
产物
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批次培养（间歇培养）
• 培养液接种细胞后，培养过程中不再添加培养基或其它， 细胞生长消耗营养并形成产物，在营养消耗完后终结培 养、回收产物； • 动力学研究 – 确定产物分泌与细胞生长的关系 • 生长相关 • 非生长相关 • 复合型 – 计算 • 产物比生产速率 • 主要底物比消耗速率
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批次培养 - 高通量细胞培养系统
• 培养基成分品种多（50-70），且常伴有协调作用 • 每个营养成分对细胞株呈现不同作用模式，包括生长支 持与生长抑制（毒性），因此需要确定单一成分的可采 用剂量范围，并为培养基优化和反应器操作模式选择提 供基础 • 细胞计数工作量浩大 • 高通量培养结合 DOE
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细胞株的生产能力
• 合成蛋白质产物的能力评估 – 单位时间内每个细胞分泌蛋白质的平均值 – 经克隆筛选之后，每个细胞株为单克隆，其 合成蛋白质产物的能力基本上已经达到上限， 重复筛选进一步提高产率的空间不大
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工艺过程开发与优化概括（1）
• 细胞驯化 – 来源可能是有血清贴壁培养 – 使细胞适应无血清或无蛋白悬浮培养 • 动力学研究 – 确定产物合成与细胞生长的关系 – 了解细胞的代谢特点，包括营养需求 与副产物生成 – 了解物理参数的影响（如降温）