实验四细菌、真菌、放线菌的分离与培养

实验报告

课程名称：环境微生物学实验实验类型：综合实验

实验项目名称：微生物的分离与培养与菌落观察

学生姓名：专业：环境工程学号：

同组学生姓名：

指导老师：

实验地点：实验日期：2018 年 10月16日

一、实验目的和要求

1.掌握微生物接种培养技术

2.掌握微生物分离纯化技术

3.学习并掌握放菌落形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。

二、实验内容和原理

土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现具有重要价值微生物的主要菌源。在不同土壤中，各类微生物的数量千差万别。为了分离获得某种微生物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗生素抑制不需要的微生物，例如，添加链霉素25~50U/mL抑制细菌;添加%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL抑制霉菌。通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微生物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。挑取单个菌落转接至新鲜平板上，即可使目的菌种纯化。

1.菌种的分离纯化：从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离

与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分

离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“单一性”，防止其他微生物的

混入。

2.平板涂布法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且

采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微

生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。用途上，一般多用于从菌种的纯化;优点是可

以观察菌落特征，对混合菌进行分离;但不能计数

3.平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表

面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。用途一般多用于筛选菌株。一般用于平板培养基的回收率计数。优点是可以计数，可以观察菌落特征。缺点是吸收量较少，较麻烦，平板不于燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度天的话，长不出单菌落。

4.稀释倒平板法：稀释倒平板法是将细菌与液态的培养基混合后倒入培养皿再冷却凝固，使样品中

的微生物细胞充分分散开，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，单个细胞及聚在一起的细胞可以生长繁殖，形成一个肉眼可见的菌落，统计菌落数目，即可用以评价样品中的微生物的数量。所以细菌在培养基的内部和表面都有,适合厌氧型微生物。

5.菌种保藏：菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征

和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。保藏菌种一-般是选用它的休眠休，如孢子;芽孢等等，并且要创造一一个低温;干燥; 缺氧;避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，从而达到长期保存的目的

6.菌落特征观察

7.微生物分离培养结果观察：

在环境样品的微生物分离过程中，虽然用了不同的培养基并添加了一定的选择性抑茵物，但并不能保证牛肉膏蛋白胨培养基上长的都是细苗，高氏号培养基上长的都是放线菌，马铃薯蔗糖培养基上长的都是真茵。因此，必须对微生物的的落形态进行识别。

*菌落识别：菌落特征是细胞(首丝群体形态在宏观上的反映，是鉴定各类微生物的重要形态学指标。熟悉和掌握四大类敬生物细菌、放线菌、酵母药、需菌茵落形态的特征，对于菌种识别和筛选具有重要作用。

*移植：从疏离孤独的单药落中挑取培养物接种至新鲜培养基。

三、主要仪器试剂（必填）

1.菌源:选定采取土样的地点后，铲去表士层(2~3 cm)，取深层(3~10 cm)土壤109.装入无菌牛皮袋

内，封好袋口，并记录取样地点、环境特征和详细日期。取回土样后，及时分离菌种，若不能及时分离,将土样保存在低温、干燥的条件下，尽可能减少菌相变化。

2.培养基(10 mL装):牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，淀粉琼脂培养基，马铃薯蔗糖培养基。

3.无菌水:在250 mL锥形瓶中,灌装45 mL蒸馏水，放人10粒玻璃珠;在5~7支试管中灌装9mL蒸馏

水，灭菌备用。

4.试剂:5000 U/mL链霉素液;%重铬酸钾液或50 U/mL制霉素。

5.其他用品:无菌培养皿，无菌移液管，无菌三角玻棒接种环酒精灯，特种铅笔，标签纸，胶水，天

平,恒温水浴锅，恒温培养箱。

四、操作方法和实验步骤

1.土壤稀释液的制备：称取5克土至装有45ml无菌水的三角瓶(佛政璃珠)中，振荡10min (注意不

要弄湿瓶塞)后，即成1O^-1的土壤悬液，静置30秒后取样。取三支装有9ml无菌水的试管，分

月编上10^-2、10^-3。10^-4.用无菌吸管收取土壤悬液1ml，移入10^-2管中反复吹吸三次，充

分混匀后即得10^-2稀释液，换一只无菌试管依次10^-3、10^-4稀释液。

2.划线法分离细菌：曲一瓶培养基先倒平板，带平板凝固后，用接种环从相应的土壤悬液取一环用

分区划线法在平板上划线。在28~30度下倒置培养，观察。

3.涂布法分离放线菌：倒平板前先加重铬酸钾于灭菌培养皿中，并取配置好的培养基到平板。轻轻

混匀培养皿上的重铬酸钾与培养基。待培养基干固后，用移液管移取土壤稀释液于平板上，用三

角波棒轻轻涂抹，在表面均匀抹开，在28~30度下倒置培养6~7天，观察。

4.混菌法分离真菌：取5000U/ml链霉素至于培养皿一边，再分别取10^-4、10^-3土壤稀释液各1ml，

至于培养皿另一边，严防二者相混。向每皿倒入以融化并冷却至50度左右的真菌培养基，将培

养基放在桌上进行运转，使菌液、链霉素、培养基混合均匀。待凝固后，在28~30度下倒置培养

5~6天，观察

5.细菌的分离纯化：

(1)细茵:挑取单菌落，以分区划线法在平板培养基上进步分离纯化，后续进行生理生化鉴定。

(2)放线菌:挑取单菌落，移植至斜面培养基

(3)真菌:挑取单菌落，移植至斜面培养基

五、实验结果与分析