免疫组化基本技术

3.穿刺标本的取材： 光镜（HE、特殊染色、IHC、ISH） 电镜（透射电镜、免疫电镜）
4.尸检组织的取材 病人死亡后，一般要在数小时后才能 做尸检，因此，及时取材，尽早固定是开
展IHC检测的关键。
二、动物组织标本的取材 动物的处死方式一般为活杀，组织标 本来源较新鲜，10min内即可完成固定和冷 冻保存，脑组织和神经组织应采用灌注固 定后，再进行后固定。
类固定剂其固定原理主要是对蛋白 质的沉淀而发生固定作用。
3.固定方法的选择及注意事项 (1)大小 2cm×2cm×0.3cm (2)及时固定
(3)固定时间 固定时间要视组织块的厚
薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原
则上，组织块大小与固定时间成正比，固 定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。 (4)组织固定后必须彻底冲洗。
3.常用的透明剂：(1)二甲苯；(2)甲苯；
(3)苯；(4)香柏油；(5)苯甲酸甲酯；(6)
氯仿；(7)冬青油;(8)苯胺油
4.原则
脱水方法甚多，一般需逐级进行
脱水，否则可引起组织强烈收缩，组织变
形。 在脱水完全的前提下，组织的透明必 须彻底，但不能过长，否则会引起组织切 片困难。
5.常规石蜡包埋过程 (1)脱水：75％、85％乙醇，95％Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ乙醇，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。 (2)透明：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ
5.取材时间 原则上，应尽快取材，但比较大的手
术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定 后取材。
6.注意包埋方向
7.边缘标记
8.保持材料的清洁 9.切除不需要的部分 10.明确编号，登记 11.骨组织还需脱钙
四、细胞材料的准备
细胞的取材和制片法：
1.印片法：常用于活检或手术切除标本。 将新鲜标本沿病灶中心剖开，将病灶区轻 压于载玻片上，吹干后立即固定20～30min。
1.手术切除标本的取材： 抗原在组织中的分布常不均一，取材 时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交 界处，远离病灶的正常组织。 组织大小：长1cm×宽1cm×厚0.2～0.3cm。
2.各种小组织的活检取材： 它不仅体积小，取材困难，不易取到
主要病灶，因此对标本的处理应特别慎重， 及时固定，包埋时要平整。
（3）富于粘液的标本，未经处理 不宜做IHC。
4.活细胞标本的制备法
培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁 细胞可将 （1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成
悬液（106）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，
凉干后固定。
（2）将细胞直接培养在盖玻片上。
（3）将细胞直接培养在6孔或9孔板上，经 固定后可行IHC。
染色。 3.IgG的交叉反应
4.共同抗原决定簇 5.单一决定簇抗体的异质性 6.特异性抗原弥散 7.IgG受体干扰 8.鼠源性抗体检测鼠源性组织
解决方法：
1.用正常二抗血清吸附
2.将组织用酶消化或抗原修复 3.二抗用木瓜酶将抗体结合部Fab切除 4.高度稀释特异性一抗
五、酶消化和抗原修复 1.为什么要进行酶消化和抗原修复？ (1)固定液的影响 自1893年Ferdinand Blum创立组织固定以来，为了避免组织固 定液对抗原决定簇的影响，已经寻找到几 十种固定液，目的就是为了对一定抗原起 到保护作用，同时还能获得良好的组织形 态结构。
2.新鲜组织经适当固定后，装入冻存管 中，-80℃冻存。 3.蜡块的保存
4.活细胞的保存 可根据需要将细胞直
接培养在盖玻片上，9孔板上的细胞可
经固定后-80℃保存备用，大容量培养
的细胞收集冻存在液氮中。
第二部分
IHC的一些基本技术
主要内容
一、实验的设计
二、石蜡切片的脱蜡至水
三、内源性酶的消除方法
重铬酸钾
氯化汞
25mg
10g
冰醋酸
蒸馏水
50ml
800ml
(5)Zamboni S液
多聚甲醛
饱和苦味酸
20g
150ml
PB液至
1000ml
(6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛
固定液。该固定剂较适合于富含糖类组织，
对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
(7)PLPD固定液 取PLP固定液25ml，加
六、组织脱水、浸蜡及包埋 1.目的 由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只
溶解在二甲苯类试剂中。因而,组织经固定和水洗
后含大量水分,需用乙醇类试剂进行脱水,水脱完
后,组织内含有大量的乙醇,还必须用能溶解乙醇
的二甲苯来置换,最后经浸蜡,组织细胞内被大量
石蜡支称,才使组织能用于石蜡切片。
2.脱水剂的种类：非石蜡溶剂的脱水剂和 脱水兼石蜡溶剂的脱水剂。 常用的脱水剂:(1)乙醇；(2)丙酮； (3)正丁醇；(4)淑丁醇；(5)环乙酮；(6) 松脂醇；(7)二氧陆环。
（5）防止细胞过度收缩或膨胀而失 去其原有形态结构。
（6）经过固定的组织能对染料产生
不同的亲和力而着色清晰，便 于辨认。
2.固定液的种类
(1)甲醛固定液
10％福尔马林 10％中性福尔马林 10％中性缓冲福尔马林
(2)4％多聚甲醛固定液 (3)Bouin S液及改良Bouin S液 (4)Zenker S液
6. 过碘酸-硼酸钠：0.5%过碘酸10min， 经洗后1％硼酸钠处理10min。
7.20mol/L-100mol/L抗坏血酸30～ 60min。
(二)内源性碱性磷酸酶的消除方法 1. 10％醋酸 10min
2. 0.5mol/L碳酸氢钠（pH9.0） 20min
3. 1mol/L左旋咪唑 20min
(3)浸蜡：石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ
(4)石蜡包埋：修蜡块，标号
6.根据本实验室经验各种不同类型组织
的石蜡包埋条件 (1)大动物组织（狗、兔、小儿尸检）脱 水、透明和浸蜡时间
75％乙醇30～120min，85％乙醇30～ 120min，95％乙醇Ⅰ 2h，95％乙醇Ⅱ 2h， 95％乙醇Ⅲ过夜，无水乙醇Ⅰ30～60min， 无水乙醇Ⅱ30～60min，无水乙醇 Ⅲ60min～120min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各
(3)切片厚2～4μ m。
(4)切片刀要快
(5)编上号
(6)切片可在4℃保存数年（石蜡切片）
(7)冰冻切片后需凉干后立即固定 (8)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组 织需经庶糖处理24h，冰冻切片。
(9)冰冻切片固定后-80℃保存备用
八、组织与细胞材料的保存
1.冷冻保存：
-80℃，-145℃，-198℃ 组织应在离体30min内，快速取材，放 入专用冷冻管中，并编上号，登记在册。
入2.5%重铬酸钾25ml。
(8)Kanovsky S液 (9)Methacarn固定液 甲醇60ml，氯仿 30ml，醋酸10ml，混均后4℃保存备 用，对核内抗原的保存效果较好。
(10)PEG液
(11)0.4%对苯醌 (12)碳二亚酰胺-戊二醛（ECG-G）液
(13)丙酮及醇类固定剂
丙酮、乙醇
动物处死方法： 1.麻醉法 乙醚或4％戊巴比妥静注 2.空气栓塞法 3.断头法 4.击头法 5.股动脉放血法
三、组织取材注意事项 1.组织要求离体后30min内浸入固定液， 尤其是开展分子生物学工作。动物组织取
材要求心脏还在跳动时取材。
2.注意防止人为因素的影响
刀和剪要快，刀要足够长。
3.组织块的大小 厚为0.1～0.3cm，大小可根据需要而定 4.动物和人体组织的取材位置 要视研究目的，观察部位而定
片，需连续有序，防止脱片等特殊要求。
1.切片前的准备工作 (1)载玻片的清洁：市售载玻片需经清 洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡， 凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需 将玻片240℃烤2h。
(2)切片粘合剂的种类
多聚赖氨酸（分子量300KDຫໍສະໝຸດ Baidu：0.5%浓度。
APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）：干 净载玻片→丙酮5min →APES（1ml+50ml丙酮）： 用镊子夹住浸入APES试剂1～3次→纯丙酮洗二次 →干燥玻片→用铝箔包好，室温或4℃保存备用。
五、组织标本的固定 1.目的 (1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶 和腐败，以保持组织细胞的固有形态。 (2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等
各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它
原有的结构与生活时相仿。
（3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起
来而产生不同的折射率，造成光学
上的差异，以便染色后易于鉴别和 观察。 （4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、 增加组织硬度、便于制片。
(三)内源性生物素的消除方法
1.用2-甲基-D苷露糖饱和生物素 2.先用25μ g/ml卵白素孵育15min，PBS 洗10min，移至生物素饱和液中处理15min， PBS洗15min。
四、IHC的非特异性染色
1.特异性抗体不纯
2.抗体免疫球蛋白所带电荷与检测
组织所带电荷差异很大，可引起非特异
15min（可视观察结果而定），石蜡
Ⅰ30min，石蜡Ⅱ1～2h，石蜡Ⅲ2～3h。
(2)小动物组织脱水、透明和浸蜡时间 75％乙醇30min，85％乙醇30min，95 ％乙醇Ⅰ1h，Ⅱ1h，Ⅲ过夜或2h，无水乙 醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min，二甲苯Ⅰ15min, Ⅱ10min，Ⅲ10min（肉眼观察），石蜡 Ⅰ30min，石蜡Ⅱ30min，石蜡Ⅲ1～2h。
铬矾明胶液： 铬矾0.5g 明胶5g H2O2 1000ml
甲醛明胶液： 40％甲醛2.5ml 明胶0.5g H2O2 100ml
2.石蜡切片： 3.冰冻切片：IHC冰冻切片，ISH冰冻切片 (恒冷箱冰冻切片机和开放式冰冻切片机)
4.切片要求及注意事项：
(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。 (2)52－60℃烤片18h。
4.每批实验应用同一稀释度的一抗，孵育 时间和温度，同一的显色时间。 5.列出阳性判定的标准
6.预期达到的目标
二、石蜡切片脱蜡至水
冰冻切片从-80℃取出，凉干或电吹风 吹干后可直接进行免疫组化标记。石蜡切
片需经如下脱蜡才能做IHC。
二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ10min， 二甲苯10minⅢ，无水乙醇2min，95％
《免疫组化基本技术》
第一部分
组织与细胞材料的制备
内容：组织与细胞材料 的取材和保存
主要内容
一、人体组织标本的取材 二、动物组织标本的取材 三、取材注意事项 四、细胞标本的准备 五、组织的固定、脱水、透明和包埋 六、切片 七、组织与细胞材料的保存
概
述
免疫组织化学（Immunohistochemistry;
IHC） 技术是一门综合性技术，除了具备
优质、高效，特异的一抗，敏感的检测方法，
稳定的显示系统外，还需要掌握组织标本或
标本的取材、固定、包埋、切片，以及IHC
前的处理，内源性酶的消除方法，非特异背
景的消除方法，怎样防止IHC染色过程中的
脱片。
一、人体组织标本的取材 手术切除标本，各种活检穿刺 标本和尸体解剖标本。
乙醇2min，85％乙醇2min，75％乙醇 2min，流水冲洗。
三、内源性酶的消除方法
(一)内源性过氧化物酶的消除方法：
1. 0.3%～3%H2O2甲醇液20min 2. 1％ H2O2 20min 3. 3％苯肼溶液 37℃ 1h 4. 0.075%盐酸甲醇液 30min
5.DAB-H2O2溶液中加0.005M NaN3
优点：操作简单，抗原保存好 缺点：细胞厚薄不均，IHC染色易引起背 景染色。
2.穿刺吸取法
3.沉淀法 主要用于胸水、腹水、尿 液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本。
（1）常规细胞玻片制片法 （2）单核细胞分离法
3.制备细胞玻片应注意
（1）易脱片；
（2）细胞应集中在直径0.6～
1.0cm的圆圈内，总数105-106；
目前无一种固定液适用于所有的抗原，从 组织细微结构的保存，稳定、简便和廉价 综合评估上，甲醛最优。
四、IHC的非特异性染色
五、抗原的暴露和修复 六、抗体的购置及注意事项
七、抗体最佳稀释度的测定和保存
八、显示系统及衬染剂的选择和配制
九、IHC常用缓冲液
一、实验的设计
1.查阅相关文献，列出要做的 IHC指标，根据经费情况，选择相 关公司购置特异性抗体和检测试剂。
2.列出IHC实验操作流程，选择何种IHC前 处理方式。 3.通过预实验寻找第一抗体的最佳稀释度， 应设置何种对照。
(3)活检或手术切除标本的脱水透明和浸 蜡时间 75％乙醇30min，85％乙醇1h，95％ 乙醇Ⅰ1h，Ⅱ1h和Ⅲ4h或过夜，无水乙 醇Ⅰ30min，Ⅱ1～2h和Ⅲ4h，二甲苯 Ⅰ30min，Ⅱ30min和Ⅲ1h。
七、组织切片 切片可分石蜡切片、冰冻切片、火
棉胶切片，IHC切片要求不同与常规切