凝胶过滤
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二、琼脂糖凝胶
琼脂糖是由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接 构成的多糖链，在100℃时呈液态，当温度在 45℃以下时，以氢键方式相互连接成线性的双链 单环的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。
对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗 力，在pH 4.0-9.0的缓冲液中是稳定的。
琼脂糖的商品名称是因生产厂家不同而异：
当暴露于强酸或氧化剂溶液时，易使糖苷 键水解断裂。 葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加 入适量的防腐剂如氯仿、叠氮化钠等。否 则，微生物将生长。
3．吸附性
葡聚糖凝胶系弱酸性物质，因为含羧基基团。
该基团能与分离物中电荷基团（碱性蛋白质） 发生吸附作用，可提高洗脱液的离子强度。但 当离子强度大于0.05时，对弱碱性蛋白质就无 吸附力了。 葡聚糖凝胶层析时，用含有 NaCl 的缓冲液作 洗脱液。
不同型号的葡聚糖凝胶的交联度不同，膨胀 度、吸水量、筛孔的大小和分组范围有明显 的差异。
1）以G型葡聚糖凝胶作为固定相，以水溶液作 为流动相，对水溶性物质进行分离的层析方法 称为葡聚糖凝胶过滤层析。 2）以LH型葡聚糖凝胶作为固定相，以有机溶 剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方 法称为葡聚糖凝胶渗透层析。
2．稳定性
葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、 弱酸溶液和有机溶剂中稳定，不溶解，很 少产生化学降解。
在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可高温 （120℃）消毒30分钟，性质不变。在 0.1mol/L HCl 溶液中浸泡1-2小时，在 0.02mol/L HCl 溶液中浸泡6个月以上，对 分离效果无明显的影响。
各 种 凝 胶 层 析 的 基 质
一、 葡聚糖凝胶
商品名：Sephadex，由葡聚糖（右旋糖酐） （G型）和3-氯-1，2-环氧丙烷（交联剂） 以醚链相互交联而成的。
在交联葡聚糖G-25和G-50中分别加入羟丙 基基团反应，即可构成LH型烷基化葡聚糖 凝胶。
1．理化性质
葡聚糖凝胶：白色珠状颗粒，在显微镜下可 见其表面的网状皱纹。含大量羟基，亲水性 好，在水溶液或电解质溶液中极易膨胀。
琼脂糖凝胶在干燥状态下易破裂，一般存放在 含防腐剂的水溶液中，避免剧烈的搅动。
CL型交联琼脂糖：Sepharose 与1, 3-二溴异丙醇 （1, 3-dibromopropanol）在强碱性条件生成的。 优点： 其筛孔与同浓度的、未交联的琼脂糖相同，热 稳定性与化学稳定性好 可在广范围的pH溶液（pH3-14）中使用，用较 强的碱溶液短时间处理，性能不会改变。 缺点：在氧化剂存在下，会有少量的多糖链发生 解聚。
琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都 比葡聚糖凝胶好，用琼脂糖凝胶进行柱层 析时，流速可以快些。
三、聚丙烯酰胺凝胶
商品名Bio-gel。是以甲叉双丙烯酰胺（双体） 作为交联剂，以过硫酸胺为催化剂，N, N, N’, N’-四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂，将丙 烯酰胺（单体）聚合而成的。当改变单体浓度 时，就可得吸水率不同的产物，商品型号有 Bio-gel P-2到P-300。
四、 Sephacryl
Sephacryl 由烷基葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺共 价交联制成的。属硬性凝胶，具有一定大小 的筛孔和少量的羧基基团。
a.分离纯化蛋白质（包括酶类）、核酸、 多糖、激素、氨基酸和抗生素等物质 b.测定蛋白质的分子量 c.样品的浓缩和脱盐等方面
第一节 凝胶的分类及性质
性质：
凝胶不溶于水，但在水中有较大的膨胀度 和较好的分子筛功能。
分类
葡聚糖凝胶（Sephadex） 天然琼脂糖（Sepharose、Bio-gel A） 交联琼脂糖（Sepharose CL-） 聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel） 交联葡聚糖 双丙烯酰胺共聚凝胶（Sephacry1） 交联葡聚糖与葡聚糖共价结合的凝胶（Superdex）
样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大 到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
带网孔的葡 聚糖珠 小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层析过程示意图
凝胶过滤层析过程示意图
凝胶过滤的优点：
设备简单 操作方便 重复性好 样品回收率高等特点
适用：
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网 孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下 移动过程中，因此流程较长，移动速率慢，所 以最后流出。
中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗 透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以 它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的 组分先流出，分子小的组分后流出。
瑞典称 Sepharose 美国称 Bio-gel A 英国称 Segavac 丹麦称 Gelarose 我国的同类产品与瑞典相同，这些琼脂糖中除 Segavac外，都是以珠状琼脂糖凝胶形式出售。
琼脂糖凝胶按其浓度分：Sepharose 2B（2％浓 度）、4B（4％）和6B（6％）。Sepharose 6B 的机械强度大于2B，但是筛孔小于2B。
一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，以干凝胶形 式出售，使用前必须溶胀。 特点： 不溶于水和普通有机溶剂； 能在浓盐、尿素和胍盐等溶液中浸泡； 在pH l-10或短时间超过此pH值的溶液中较稳定； 要避免长期与强酸和强碱接触，否则，酰胺基将迅 速发生分解（高温条件）。
缺点： 对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有吸 附现象，使用离子强度略高的洗脱液操 作可以克服。
是20世纪60年代发展起来的 一种分离纯化方法。 又叫分子筛层析—凝胶具有 网状结构，小分子物质能进 入其内部，而大分子物质却 被排阻在外部。当一混合溶 液通过凝胶过滤层析柱时， 溶液中的物质就按不同分子 量筛分开。
adaptor
不同类型凝胶的筛孔的大小不同
凝胶过滤基本原理
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网 孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空 间向下流动，因此流程较短，移动速度快，所 以首先流出。
二、琼脂糖凝胶
琼脂糖是由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接 构成的多糖链，在100℃时呈液态，当温度在 45℃以下时，以氢键方式相互连接成线性的双链 单环的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。
对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗 力，在pH 4.0-9.0的缓冲液中是稳定的。
琼脂糖的商品名称是因生产厂家不同而异：
当暴露于强酸或氧化剂溶液时，易使糖苷 键水解断裂。 葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加 入适量的防腐剂如氯仿、叠氮化钠等。否 则，微生物将生长。
3．吸附性
葡聚糖凝胶系弱酸性物质，因为含羧基基团。
该基团能与分离物中电荷基团（碱性蛋白质） 发生吸附作用，可提高洗脱液的离子强度。但 当离子强度大于0.05时，对弱碱性蛋白质就无 吸附力了。 葡聚糖凝胶层析时，用含有 NaCl 的缓冲液作 洗脱液。
不同型号的葡聚糖凝胶的交联度不同，膨胀 度、吸水量、筛孔的大小和分组范围有明显 的差异。
1）以G型葡聚糖凝胶作为固定相，以水溶液作 为流动相，对水溶性物质进行分离的层析方法 称为葡聚糖凝胶过滤层析。 2）以LH型葡聚糖凝胶作为固定相，以有机溶 剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方 法称为葡聚糖凝胶渗透层析。
2．稳定性
葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、 弱酸溶液和有机溶剂中稳定，不溶解，很 少产生化学降解。
在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可高温 （120℃）消毒30分钟，性质不变。在 0.1mol/L HCl 溶液中浸泡1-2小时，在 0.02mol/L HCl 溶液中浸泡6个月以上，对 分离效果无明显的影响。
各 种 凝 胶 层 析 的 基 质
一、 葡聚糖凝胶
商品名：Sephadex，由葡聚糖（右旋糖酐） （G型）和3-氯-1，2-环氧丙烷（交联剂） 以醚链相互交联而成的。
在交联葡聚糖G-25和G-50中分别加入羟丙 基基团反应，即可构成LH型烷基化葡聚糖 凝胶。
1．理化性质
葡聚糖凝胶：白色珠状颗粒，在显微镜下可 见其表面的网状皱纹。含大量羟基，亲水性 好，在水溶液或电解质溶液中极易膨胀。
琼脂糖凝胶在干燥状态下易破裂，一般存放在 含防腐剂的水溶液中，避免剧烈的搅动。
CL型交联琼脂糖：Sepharose 与1, 3-二溴异丙醇 （1, 3-dibromopropanol）在强碱性条件生成的。 优点： 其筛孔与同浓度的、未交联的琼脂糖相同，热 稳定性与化学稳定性好 可在广范围的pH溶液（pH3-14）中使用，用较 强的碱溶液短时间处理，性能不会改变。 缺点：在氧化剂存在下，会有少量的多糖链发生 解聚。
琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都 比葡聚糖凝胶好，用琼脂糖凝胶进行柱层 析时，流速可以快些。
三、聚丙烯酰胺凝胶
商品名Bio-gel。是以甲叉双丙烯酰胺（双体） 作为交联剂，以过硫酸胺为催化剂，N, N, N’, N’-四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂，将丙 烯酰胺（单体）聚合而成的。当改变单体浓度 时，就可得吸水率不同的产物，商品型号有 Bio-gel P-2到P-300。
四、 Sephacryl
Sephacryl 由烷基葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺共 价交联制成的。属硬性凝胶，具有一定大小 的筛孔和少量的羧基基团。
a.分离纯化蛋白质（包括酶类）、核酸、 多糖、激素、氨基酸和抗生素等物质 b.测定蛋白质的分子量 c.样品的浓缩和脱盐等方面
第一节 凝胶的分类及性质
性质：
凝胶不溶于水，但在水中有较大的膨胀度 和较好的分子筛功能。
分类
葡聚糖凝胶（Sephadex） 天然琼脂糖（Sepharose、Bio-gel A） 交联琼脂糖（Sepharose CL-） 聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel） 交联葡聚糖 双丙烯酰胺共聚凝胶（Sephacry1） 交联葡聚糖与葡聚糖共价结合的凝胶（Superdex）
样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大 到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
带网孔的葡 聚糖珠 小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层析过程示意图
凝胶过滤层析过程示意图
凝胶过滤的优点：
设备简单 操作方便 重复性好 样品回收率高等特点
适用：
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网 孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下 移动过程中，因此流程较长，移动速率慢，所 以最后流出。
中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗 透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以 它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的 组分先流出，分子小的组分后流出。
瑞典称 Sepharose 美国称 Bio-gel A 英国称 Segavac 丹麦称 Gelarose 我国的同类产品与瑞典相同，这些琼脂糖中除 Segavac外，都是以珠状琼脂糖凝胶形式出售。
琼脂糖凝胶按其浓度分：Sepharose 2B（2％浓 度）、4B（4％）和6B（6％）。Sepharose 6B 的机械强度大于2B，但是筛孔小于2B。
一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，以干凝胶形 式出售，使用前必须溶胀。 特点： 不溶于水和普通有机溶剂； 能在浓盐、尿素和胍盐等溶液中浸泡； 在pH l-10或短时间超过此pH值的溶液中较稳定； 要避免长期与强酸和强碱接触，否则，酰胺基将迅 速发生分解（高温条件）。
缺点： 对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有吸 附现象，使用离子强度略高的洗脱液操 作可以克服。
是20世纪60年代发展起来的 一种分离纯化方法。 又叫分子筛层析—凝胶具有 网状结构，小分子物质能进 入其内部，而大分子物质却 被排阻在外部。当一混合溶 液通过凝胶过滤层析柱时， 溶液中的物质就按不同分子 量筛分开。
adaptor
不同类型凝胶的筛孔的大小不同
凝胶过滤基本原理
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网 孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空 间向下流动，因此流程较短，移动速度快，所 以首先流出。