药敏试验结果分析

6种抗生素类药物对大肠杆菌的体外抑菌试验
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（山东农业大学）
摘要:研究6种抗生素药物对大肠杆菌体外抑菌的作用。

通过在琼脂平皿上贴药敏片，测量抑菌圈的直径来确定抑菌作用。

结果表明大肠杆菌对青霉素、头孢他啶表现中度敏感，其他表现为高度敏感
关键词:抗生素；大肠杆菌；抑菌
文献综述：
大肠杆菌是肠杆菌科埃希菌属中具有代表性的菌种，主要寄居在人和动物肠道中，其特性为革兰氏阴性，对营养要求不高，在普通培养基上就能很好的生长，并广泛分布于水、土壤或腐败物中。

禽大肠杆菌病是由埃希氏大肠杆菌引起的多种病的总称，包括大肠杆菌性肉芽肿、腹膜炎、输卵管炎、脐炎、滑膜炎、气囊炎、眼炎、卵黄性腹膜炎等疾病，对养禽业危害严重。

大肠杆菌病的发生，常与许多不利的外界条件密切相关。

发生时具备如下特点：发病率高，死亡率高，复发率高；各日龄均易感染，症状典型；混合感染严重；传播途径较多：呼吸道、消化道（包括滥用药物引起的肠道菌群失调）、垂直传播；治疗困难。

多年来，随着抗生素的大量应用致使大肠杆菌病的耐药菌株越来越多，耐药谱也越来越广。

本实验通过6种临床常用抗生素对大肠杆菌的药敏试验，检测临床常用的六种抗生素对大肠杆菌的敏感性以便准确有效的利用药物进行治疗。

1 药敏实验简介
抗菌药物敏感性试验（AST，简称药敏试验）：用于测试抗菌药物在体外对病原微生物有无抑制作用。

常用最低抑菌浓度（MIC）表示，即体外能够抑制细菌生长的最低药物浓度。

通常根据MIC结合常用剂量时体内该药所能达到的血药浓度，划定细菌对各种抗生素敏感或耐药的界限，给出S（敏感）、I（中介）、R（耐药）等定性的结果来分别表示实验菌对抗菌药物的敏感性。

高度敏感（s ）表示用某种药物治疗某种细菌引起的感染常用剂量就有效，或者说常规剂量达到的平均血药浓度超过该药对细菌的MIC 的5 倍以上；中度敏感（I ）表示用某种药物治疗某种细菌引起的感染仅在高剂量时才有效，或者说常规剂量达到的血药浓度相当于或略高于对细菌的MIC ; 耐药（R ）表示药物对某一细菌的MIC（最
低抑菌浓度）高于治疗量的药物在血液或体液内可能达到的浓度，或细菌能产生灭活抗菌药的酶，无论其MIC 值大小都要判定为耐药。

2 药敏试验的目的
2.1 检测病原菌对各种抗生素的敏感性，指导临床合理用药。

2.2用于流行病学调查及院内感染的监控，控制和预防耐药菌株的流行。

2.3 为经验用药提供参考依据。

3 药敏试验的应用
药物敏感实验后，应选择高敏药物进行治疗，也可选用两种药物协助使用，以减少耐药菌株。

在选择高敏药物时应考虑药物的吸收途径，因为我们药敏实验是药液直接和细菌接触，而在给禽用药的时候，必须通过机体的吸收才能使药物达到一定的效果，所以在给禽用药时，高敏药物一定要配合适宜的给药方法，这样才会达到好的治疗效果。

4 抗菌药物的选择原则
4.1针对不同类别的细菌，应该有选择的进行抗菌药物敏感试验。

不同细菌需要测试的药物可能有所不同。

如红霉素用于葡萄球菌的测试而不用于肠杆菌的测试。

4.2不需要对每种抗生素均进行测试。

选择的药物应该为各类抗生素的代表性药物。

4.3 NCCLS（美国临床实验室标准委员会）将测试药物根据不同细菌分为4组。

A组为首选药物必须常规报告；B组为与A组平行的药物，但可以选择性报告；C组为补充药物，当对A组、B组药物呈现多重耐药时必须报告；D组为用于尿路感染测试的药物。

4.4 每种药物需要测试的药物浓度各不相同，对应的敏感或耐药的MIC值也不相同，NCCLS在经过认真地验证后给出了相应的判断标准。

5 药敏试验分类
5.1 纸片扩散法
该法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成浓度梯度。

同时，纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长，
二抑菌范围外的菌株则可以生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈，不同的抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的MIC呈负相关。

5.2 稀释法
稀释法药敏试验可用于定量测试抗菌药物对某一细菌的体外活性，分为琼脂稀释法和肉汤稀释法。

实验时，抗菌药物的浓度通常经过倍比（lg2）稀释，能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度成为最小抑菌浓度（MIC），一个特定抗菌药物的测试浓度范围应该包含能够检测细菌的解释性折点（敏感、中介和耐药）的浓度，同时也应该包含质控参考菌株的MIC.
5.3 琼脂稀释法首先制备含抗菌药物的琼脂稀释平板。

再接种待测菌株，然后是结果判读。

5.4 肉汤稀释法
5.5 抗生素浓度梯度法
5.6 自动化仪器法
实验步骤
1 材料
1.1 材料
1.1.1 试验药物青霉素、氨苄西林、头孢唑啉、头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶1.1.2 试验菌种大肠杆菌
1.1.3 试验时间2012年6月17日～2012年6月18日
1.1.4 试剂与仪器试剂：氯化钠、氢氧化钠、琼
脂、牛肉膏、蛋白胨、纯化水。

仪器：电热恒温培养箱、压力蒸汽器、电子天平、微量加样器、EP管、锥形烧瓶、平皿、曲玻棒、接种棒、滤纸。

2.2 方法
2.2.1肉汤的制备：
用料牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂20—30g、蒸馏水1000mL。

2.2.1.1称量：依次称取各种成分，牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水融化后到入烧杯，蛋白胨易吸湿，称量时要迅速。

2.2.1.2溶解：在烧杯中加入少于所需的水量，加热，逐一加入各成分，使其溶解，琼脂在溶液煮沸后加入，融化过程需不断搅拌。

加热时应注意火力，勿使培养基烧焦或溢出。

溶好后，补足所需水分。

2.2.1.3调pH值：若PH值不适宜，可用1mol/L NaOH或1mol/LHCl把pH值调至所需范围。

2.2.1.4过滤：趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察，如无特殊要求时可省去此步骤。

2.2.1.5分装：按照实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角瓶内，分装时注意，勿使培养基沾染在容器口上，以免沾污棉塞引起污染。

2.2.1.6加棉塞：分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉花，以阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性能。

2.2.1.7包扎：棉塞上包一层牛皮纸，扎紧，即可进行灭菌。

2.2.1.8灭菌：将上述培养基以0.1Mpa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。

2.2.1.9搁置斜面：将灭菌的试管培养基管口端搁在玻璃棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长度的一半为宜。

2.2.1.10无菌检验：灭菌后的培养基放入37℃恒温箱中培养24h，以检验灭菌效果，无污染方可
2.2.2琼脂培养基的制备：
将灭菌好的琼脂倾倒到培养皿中，每只灭菌培养皿倒入10~15ml,将皿盖盖好。

2.2.3 细菌的培养：
2.2.
3.1接种：将菌种试管与待接种的试管培养基依次排列，挟于左手的拇指与食指之间，用右手的中指与食指或食指与小指拔出棉塞并挟出。

置试管口于酒精火焰附近；将接种环垂直插入酒精火焰中烧红，再横过火焰三次，然后再放入有大肠杆菌试管壁内，于无菌的培养基表面待其冷却。

用接种工具取少许菌种置于另一支试管中，按一定的接种方式把菌种接种到新的培养基上。

取出接种工具，试管口和棉塞进行火焰灭菌。

重新塞上棉塞。

烧死接种工具上残留余菌，把试管和接种工具放回原处。

2.2.
3.2分离:在无菌的条件下，分别取一接种大肠杆菌放入盛有无无菌水的试管中，制混合菌液。

在近火焰处，左手拿平板稍抬皿盖，右手持接种环蘸取一环混
合液伸入皿内划线。

2.2.
3.3培养：将接种的细菌培养基放在32～37℃恒温箱内培养24h后观察。

将接种分离后的大肠杆菌放在25～28℃的恒温箱内，大肠杆菌培养24h
2.2.4琼脂扩散纸片法
2.2.4.1在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。

具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。

然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。

（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。

要求涂布均匀致密，直接悬液法要把菌液浓度用生理盐水或PBS调到0.5个麦氏标准再涂布均匀。

）
2.2.4.2将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。

为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。

为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片（外周一般可贴七片），每种药敏片的名称要记住。

2.2.4.3将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

结果分析与讨论
1 结果：
药敏试验发现，氨苄西林、头孢唑啉、头孢曲松、头孢噻肟对大肠杆菌敏感性较好，在测定的6种药物中有青霉素、头孢他啶对大肠杆菌中度敏感。

判定标准标准参照《抗菌药物药效试验判定标准》。

抑菌圈直径小于10mm为低度敏感；
抑菌圈直径在10～18mm之间为中度敏感；
抑菌圈直径大于18 mm为高度敏感。

S（敏感）、I（中介）、R（耐药）
2 讨论
头孢菌素与青霉素相比具有抗菌谱较广，耐青霉素酶，疗效高、毒性低，过敏反应少等优点，在抗感染治疗中占有十分重要的地位。

头孢菌素已从第一代发展到第四代，其抗菌范围和抗菌活性也不断扩大和增强。

需要指出的是，代的划分主要是根据产品问世年代的先后和药理性能的不同。

这种分类并不意味着第四代产品就比三代产品好，一、二代产品就属于淘汰产品，各有不同用途。

影响抗菌作用的主要因素有：
①药物透过革兰阳性菌细胞壁或阴性菌脂蛋白外膜（即第一道穿透屏障）的难易；
②对β-内酰胺酶（第二道酶水解屏障）的稳定性；
③对抗菌作用靶位PBPs的亲和性。

根据这些因素，目前临床应用的β-内酰胺类对革兰阳性与阴性菌的抗菌作用可以分为
青霉素，易透过革兰阳性菌胞壁粘肽层，但它们不能透过革兰阴性菌糖蛋白磷脂外膜，因而属窄谱的仅对革兰阳性菌有效。

头孢类抗生素能适度透过革兰阳性菌的胞壁粘肽层，对革兰阴性菌的外膜透过性则很好，因而是广谱抗菌药物。

但第三代头孢菌素对革兰氏阴性菌大肠杆菌的敏感性明显强于前两代
参考文献
吴艳《药理学实验指导》北京人民军医出版社2004
章元沛《药理学实验》第二版人民卫生出版社1995
徐海花,常维山,秦爱建,等.鸡源致病性大肠杆菌药物耐受性与药物剂量相关性的研究 [J]. 家禽生态学报,2007,28(6):83 ～85.
倪语星，王金良，徐英春《抗微生物药物敏感性试验规范》上海科学技术出版社，2002.
教学实习论文
——药敏实验。