蛋白质的测定ppt课件
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5
第三节 蛋白质的定量测定 关于氮-蛋白质换算等数 6.25
= 6.25 = 6.38
=
5.95
6
一、凯氏定氮法
常量凯氏定氮法
1. 原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋
白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水 逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合 成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。
7
整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定 ① 消化
2NH2(CH2) 2COOH+13H2SO4 (NH4) 2SO4+6CO2+12SO2+16H2O
<1>加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点 <2>加硫酸铜 作为催化剂、消化终点指示剂 <3>加氧化剂 加速有机物氧化速度
8
9
② 蒸馏
NH4+ + OH== NH3 +H2O
22
杜马斯法（燃烧法）
样品在高温下（700-800℃）燃烧，释放的 氮气由带热导检测器（TCD)的气相色谱仪测定。 测得的含氮量转换成样品中的蛋白质含量。
23
几种蛋白质测定方法比较
凯式定氮法 双缩脲
原理
总氮量
蛋白氮
装置 溶剂
时间 灵敏
度 干扰
凯式定氮装置
浓硫酸 长
较低
较小
分光光度计 用量较少 简单快速 低
有干扰
杜马斯
福林-酚
总氮量
蛋白氮
高温装置、GC 分光光度计
不需要
福林-酚试剂
3min 高
简单快速 高
较小
酸类及柠檬 酸类
24
其他方法
染色法 紫外 吸收法
水杨酸比色法
25
采用凯氏定氮法测一样品的粗蛋白含量，根据下 列记录的数据计算：
水份含量=8.0%，1 号样品重量=1.015g，2号样 品重量=1.025g，用于滴定的标准HCl浓度 =0.1142mol/L，1号样品所用的HCl溶液的毫升数 =22.0mL，2号样品的HCl溶液的毫升数=22.5mL， 空白的HCl溶液的毫升数=0.2mL，分别以样品的干 基和湿基计算粗蛋白质含量，假定该蛋白质含有 17.5%的氮。
指示剂 红色
绿色
红色
（酸）
（碱）
（酸）
反应式为： NH3+H3BO3==NH4++H2BO3H2BO3-+H+==H3BO3
<2> 用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再
Fra Baidu bibliotek
用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液。
12
现测定某一种食品的蛋白质的含量， 这种样品含有大大量量的的脂脂肪肪 ，样品经过处理 后加入浓硫酸，为了使浓硫酸与样品充分 结合，经振振摇摇后大大火火加热热进行消化；消化化 22hh后后，，估估计计消消化化完完全全，取出消化液加入少少 量量NNaaOOHH进行蒸馏，硼酸（加入了指示剂甲 基红-溴甲基酚绿）作为吸收液，最后对 吸收液进行滴定。
10
影响氨化完全和速度的因素
（1）K氏烧瓶和取样量 （2）分解剂
1g样品 K2SO4： H2SO4 = 7g : 12ml 还有一种比例： K2SO4： H2SO4 = 10g : 20ml
11
③ 吸收与滴定
<1>用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定
指示剂：混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿）
1.装水至 2/3 容积 处，加甲 基橙数滴 及硫酸数 毫升以保 持酸性
4.NaOH 溶液
4.5.6 5.水洗漏 步操 斗数次 作要 6.夹好漏斗 迅速 夹，水封。
2.管下端 插入液面 下(瓶内先 装硼酸液 及混合指 示剂2滴)
7.水蒸气蒸馏至指示剂变绿色 开始计时，蒸馏10min，将管 尖端提离液面再蒸馏1min ，用 水冲洗管尖后停止蒸馏
A540
白质浓取度两为组横测坐定标的，A54绘0值制的标平准均曲值线，。即A540为纵坐标，蛋19
2、样品测定
取4支试管分成两组，按下表平行操作：
0
1
样品稀释液/ml
0.5
蒸馏水/ml
1.0
0.5
双缩脲试剂/ml
4.0
4.0
A540
20
3、计算
取两组测定的平均值计算：
固体样品蛋白质的含量(%) Y N 100% c
8.吸收液用0.01000mol/L HCl标准溶液滴定至 微红色为终点
同时做空白 15
凯氏定氮仪
16
凯氏定氮仪
17
二、双缩脲法
NH2—CO—NH2 + NH2—CO—NH2 △150~160℃ NH2—CO—NH—CO—NH2 + NH3 双缩脲
双缩脲能和硫酸铜的碱性 溶液生成紫紫色色络络和合物物。
第九章 蛋白质及氨基酸的测定 Determination of protein and amino acid in Food
1
第一节 概述
1.蛋白质的元素组成（The elements of protein）
C：50-55% N：15-18% O：20-23% H：6-8% S：0-4% 微量元素：P、Fe、Zn、Cu 2、基本结构单位：氨基酸 3、蛋白质的变性作用。
Y为标准曲线查得蛋白质得浓度（mg/ml） N为稀释倍数 c为样品原浓度（mg/ml）。
21
福林-酚法（双缩脲法的发展）
两步反应
(1)在碱性条件下，蛋白质与铜离子作用生成蛋 白质—铜络合物。 (2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(Ｆolin试剂) 还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物) 。
13
计算
V V M C( ) K 100%
X=
1
2
N
W 1000
X为样品中蛋白质的含量
V1为样品消耗盐酸标准液的体积 V2为试剂空白消耗盐酸标准液的体积 C为盐酸标准液的浓度
MN为氮的摩尔质量
W为样品的质量
K为氮换算为蛋白质的系数
14
微量凯氏定氮法 3.消化液 10mL
2
4、蛋白质分析的重要性
生物活性测定 功能性质调查 营养标签
总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值
3
5、蛋白质的测定方法
利用蛋白质共性的方法
凯氏定氮法 杜马斯法
福林酚法
利用特定氨基酸残基法
染色法
4
第二节 蛋白质的定性测定
一、蛋白质的一般显色反应 电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并 变色。书中列举了 5 种染料。 二、复合蛋白质的显色反应 （一）糖蛋白的显色（3种方法） （二）脂蛋白的显色（2种方法）
18
操作方法
1、制作标准曲线 取10支干试管分成两组，按下表平行操作：
0
1
2
3
4
5
标准蛋白液/ml
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蛋白浓度 /(mg/ml)
2.0 4.0 6.0 8.0 10.0
蒸馏水/ml
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
双缩脲试剂/ml 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
第三节 蛋白质的定量测定 关于氮-蛋白质换算等数 6.25
= 6.25 = 6.38
=
5.95
6
一、凯氏定氮法
常量凯氏定氮法
1. 原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋
白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水 逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合 成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。
7
整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定 ① 消化
2NH2(CH2) 2COOH+13H2SO4 (NH4) 2SO4+6CO2+12SO2+16H2O
<1>加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点 <2>加硫酸铜 作为催化剂、消化终点指示剂 <3>加氧化剂 加速有机物氧化速度
8
9
② 蒸馏
NH4+ + OH== NH3 +H2O
22
杜马斯法（燃烧法）
样品在高温下（700-800℃）燃烧，释放的 氮气由带热导检测器（TCD)的气相色谱仪测定。 测得的含氮量转换成样品中的蛋白质含量。
23
几种蛋白质测定方法比较
凯式定氮法 双缩脲
原理
总氮量
蛋白氮
装置 溶剂
时间 灵敏
度 干扰
凯式定氮装置
浓硫酸 长
较低
较小
分光光度计 用量较少 简单快速 低
有干扰
杜马斯
福林-酚
总氮量
蛋白氮
高温装置、GC 分光光度计
不需要
福林-酚试剂
3min 高
简单快速 高
较小
酸类及柠檬 酸类
24
其他方法
染色法 紫外 吸收法
水杨酸比色法
25
采用凯氏定氮法测一样品的粗蛋白含量，根据下 列记录的数据计算：
水份含量=8.0%，1 号样品重量=1.015g，2号样 品重量=1.025g，用于滴定的标准HCl浓度 =0.1142mol/L，1号样品所用的HCl溶液的毫升数 =22.0mL，2号样品的HCl溶液的毫升数=22.5mL， 空白的HCl溶液的毫升数=0.2mL，分别以样品的干 基和湿基计算粗蛋白质含量，假定该蛋白质含有 17.5%的氮。
指示剂 红色
绿色
红色
（酸）
（碱）
（酸）
反应式为： NH3+H3BO3==NH4++H2BO3H2BO3-+H+==H3BO3
<2> 用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再
Fra Baidu bibliotek
用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液。
12
现测定某一种食品的蛋白质的含量， 这种样品含有大大量量的的脂脂肪肪 ，样品经过处理 后加入浓硫酸，为了使浓硫酸与样品充分 结合，经振振摇摇后大大火火加热热进行消化；消化化 22hh后后，，估估计计消消化化完完全全，取出消化液加入少少 量量NNaaOOHH进行蒸馏，硼酸（加入了指示剂甲 基红-溴甲基酚绿）作为吸收液，最后对 吸收液进行滴定。
10
影响氨化完全和速度的因素
（1）K氏烧瓶和取样量 （2）分解剂
1g样品 K2SO4： H2SO4 = 7g : 12ml 还有一种比例： K2SO4： H2SO4 = 10g : 20ml
11
③ 吸收与滴定
<1>用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定
指示剂：混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿）
1.装水至 2/3 容积 处，加甲 基橙数滴 及硫酸数 毫升以保 持酸性
4.NaOH 溶液
4.5.6 5.水洗漏 步操 斗数次 作要 6.夹好漏斗 迅速 夹，水封。
2.管下端 插入液面 下(瓶内先 装硼酸液 及混合指 示剂2滴)
7.水蒸气蒸馏至指示剂变绿色 开始计时，蒸馏10min，将管 尖端提离液面再蒸馏1min ，用 水冲洗管尖后停止蒸馏
A540
白质浓取度两为组横测坐定标的，A54绘0值制的标平准均曲值线，。即A540为纵坐标，蛋19
2、样品测定
取4支试管分成两组，按下表平行操作：
0
1
样品稀释液/ml
0.5
蒸馏水/ml
1.0
0.5
双缩脲试剂/ml
4.0
4.0
A540
20
3、计算
取两组测定的平均值计算：
固体样品蛋白质的含量(%) Y N 100% c
8.吸收液用0.01000mol/L HCl标准溶液滴定至 微红色为终点
同时做空白 15
凯氏定氮仪
16
凯氏定氮仪
17
二、双缩脲法
NH2—CO—NH2 + NH2—CO—NH2 △150~160℃ NH2—CO—NH—CO—NH2 + NH3 双缩脲
双缩脲能和硫酸铜的碱性 溶液生成紫紫色色络络和合物物。
第九章 蛋白质及氨基酸的测定 Determination of protein and amino acid in Food
1
第一节 概述
1.蛋白质的元素组成（The elements of protein）
C：50-55% N：15-18% O：20-23% H：6-8% S：0-4% 微量元素：P、Fe、Zn、Cu 2、基本结构单位：氨基酸 3、蛋白质的变性作用。
Y为标准曲线查得蛋白质得浓度（mg/ml） N为稀释倍数 c为样品原浓度（mg/ml）。
21
福林-酚法（双缩脲法的发展）
两步反应
(1)在碱性条件下，蛋白质与铜离子作用生成蛋 白质—铜络合物。 (2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(Ｆolin试剂) 还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物) 。
13
计算
V V M C( ) K 100%
X=
1
2
N
W 1000
X为样品中蛋白质的含量
V1为样品消耗盐酸标准液的体积 V2为试剂空白消耗盐酸标准液的体积 C为盐酸标准液的浓度
MN为氮的摩尔质量
W为样品的质量
K为氮换算为蛋白质的系数
14
微量凯氏定氮法 3.消化液 10mL
2
4、蛋白质分析的重要性
生物活性测定 功能性质调查 营养标签
总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值
3
5、蛋白质的测定方法
利用蛋白质共性的方法
凯氏定氮法 杜马斯法
福林酚法
利用特定氨基酸残基法
染色法
4
第二节 蛋白质的定性测定
一、蛋白质的一般显色反应 电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并 变色。书中列举了 5 种染料。 二、复合蛋白质的显色反应 （一）糖蛋白的显色（3种方法） （二）脂蛋白的显色（2种方法）
18
操作方法
1、制作标准曲线 取10支干试管分成两组，按下表平行操作：
0
1
2
3
4
5
标准蛋白液/ml
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蛋白浓度 /(mg/ml)
2.0 4.0 6.0 8.0 10.0
蒸馏水/ml
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
双缩脲试剂/ml 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0