淀粉酶米氏常数测定
米氏常数测定(精)
COOCH2 NHCH2OH
HCHO
COOCH2 NH(CH2OH)2
试剂器材
试剂
1. 10～40g/L酪蛋白溶液（pH8.5）： 四种不同［S］的酪蛋白标准溶液。 2. 中性甲醛溶液：75mL分析纯甲 醛加15mL 0.25%酚酞乙醇溶液， 以0.1M NaOH滴至微红，密闭于 玻璃瓶中。（自己配制） 3. 0.25%酚酞乙醇溶液： 4. 标准0.1M NaOH溶液。 5.胰蛋白酶溶液（已配好）
液，重复上述操作，分别测出V30、V20、V10。
利用上述结果，以1/v对1/[s]作图，即求出V与 Km值。
注意事项
（1 ）实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定， 随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种， 如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速 逆反应的进行，酶在一定pH及温度下部分失活等。因此，研 究酶的活力以酶促反应的初速度为准。
此方程表明，当已知Km及V时，酶反应速度与底 物浓度 之间的定量关系。
双倒数作图法测定Km值： 1 Km 1 1 v V [S] V
胰蛋白酶的性质 胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精 氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解， 产生自由氨基端。
氨基的测定
甲醛滴定法
COOCH2 NH2
HCHO
实验十六
底物浓度对酶促反应速度的影响 ——米氏常数的测定
目的要求
（1）了解底物浓度对酶促反应的影响。
（2）掌握测定米氏常数Km的原理和方法
实验原理
Km定义： Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时 所对应的底物浓度。
Km的意义
Km是酶的特性常数之一，不同的酶Km值不同，同
一种酶与不同底物反应Km值也不同。
淀粉酶测定实验报告
一、实验目的1. 掌握淀粉酶活性测定的原理和方法；2. 了解淀粉酶在生物体内的作用及其影响因素；3. 通过实验验证不同条件下淀粉酶活性的变化。
二、实验原理淀粉酶是一种能够水解淀粉的酶，主要分为α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。
本实验采用α-淀粉酶作为研究对象，通过测定其在特定条件下催化淀粉水解的速率，来评价淀粉酶的活性。
实验原理如下：1. 淀粉酶能够将淀粉水解成葡萄糖，反应式如下：淀粉 + 水酶→ 葡萄糖2. 淀粉在碘存在下呈现蓝色，当淀粉被水解后，蓝色逐渐消失，通过测量蓝色消失的程度，可以判断淀粉酶的活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：淀粉酶、淀粉、碘液、蒸馏水、pH缓冲液、比色皿等；2. 实验仪器：恒温水浴锅、移液器、比色计、天平等。
四、实验步骤1. 准备淀粉酶溶液：将淀粉酶用pH缓冲液稀释至一定浓度；2. 准备淀粉溶液：将淀粉用蒸馏水配制成一定浓度的溶液；3. 配制碘液：将碘液用蒸馏水稀释至一定浓度；4. 设置实验组：将淀粉溶液和淀粉酶溶液按照一定比例混合，置于恒温水浴锅中，在一定温度下反应；5. 设置对照组：将淀粉溶液和蒸馏水按照一定比例混合，置于恒温水浴锅中，在一定温度下反应；6. 取样：在反应一定时间后，取出实验组和对照组的溶液，加入碘液；7. 比色：将实验组和对照组的溶液在比色计上测定吸光度；8. 计算淀粉酶活性：根据实验组和对照组的吸光度差值，计算淀粉酶活性。
五、实验结果与分析1. 实验结果：实验组吸光度：A1对照组吸光度：A22. 结果分析：根据实验结果，计算淀粉酶活性：淀粉酶活性 = (A1 - A2) / A2淀粉酶活性越高，表示淀粉酶的催化能力越强。
六、实验讨论与心得1. 实验过程中，需要注意温度、pH值等因素对淀粉酶活性的影响，以保证实验结果的准确性；2. 实验结果表明，淀粉酶活性受到多种因素的影响，如温度、pH值、底物浓度等；3. 通过本实验，加深了对淀粉酶活性的理解，为后续研究提供了实验基础。
酶工程实验报告五(纤维素酶米氏常数—Km的测定)
v = Km + [S ]v ：反应初速度（微摩尔浓度变化/min)V ：最大反应速度（微摩尔浓度变化/min)[S]：底物浓度（mol/L)Km：米氏常数（mol/L)此方程表明，当已知Km及V时，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。
3.4 双倒数作图法测定Km值：1 Km 1 1v V [S] V1/v对1/[S]作图可得一条曲线，其斜率为Km/Vmax，截距为1/Vmax 。
若将直线延长与横轴相交，则该交点在数值上等于-1/Vmax。
本实验采用最适pH、最适温度下，测定不同浓度时酶活性。
再根据林贝法作图求出Km值。
3.5 纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3，5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其3mLDNS反应终止→沸水浴5min →定容至25ml→测定OD540吸光值G 作双倒数图求Km4.3 实验注意事项本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。
底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。
严格控制准确的酶促反应时间。
反应温度准确，酶液准确稀释。
不同pH所用酶液用对应pH缓冲液稀释试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；移液管使用时量取精准，保证结果可靠准确。
精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；由图-1/Km=-7,可得出：Km=0.143 mg/ml(g/L)/(2×104)=0.715×10-5mol/L。
6、分析与讨论：米氏常数（Km）是酶的一个特征性物理量，其大小与酶的性质有关。
Km 值随测定的底物种类、反应的温度、pH 及离子强度而改变。
因此，对某一酶促反应而言，在一定条件下都有特定的Km 值，可用来鉴别酶，例如对于不同来源或相同来源但在不同发育阶段，不同生理状况下催化相同反应的酶是否属于同一种酶[1]。
淀粉酶测定方法的选定及注意事项
收稿日期:2000-3-2淀粉酶测定方法的选定及注意事项李 丽(安徽省立医院检验科,安徽合肥230001)〔文章编号〕1002-2376(2000)06-0023-01 〔中国分类号〕Q55 〔文献标识码〕B 淀粉酶测定一直受到临床关注,其测定方法有许多种。
但是,简便、准确地适合临床应用的方法却很少。
长期以来,临床根据血、尿淀粉酶增高作为急腹证的病人是否患急性胰腺炎的重要实验室依据〔1〕。
但是,实际工作中常遇到一些病例的临床症状与实验结果不相符。
所以在开展新的淀粉酶测定方法时要注意以下几点:一、11不同的测定方法有不同的参考限值,所以每开展一项新的测定方法或使用新仪器和试剂都要对其参考限值进行设置。
无论何种方法其限值要具备一定灵敏度,线性范围不能太窄,对急性胰腺炎诊断要有特异性。
二、门诊和病房的实验方法相同的重要性如果方法不同,其测定参考限值也不同。
这样就给临床医生在疾病的诊断、治疗,以及疗效观察中带来不便。
因此建议采用相同的测定方法。
但是,由于淀粉酶的特殊性,迄今为止,它的测定方法尚难以标准化。
所以,我们需根据各自医院的条件来选定一种最佳测定方法。
如果是条件所限,测定方法不能一致,一定要将其参考限值标明在化验单上,让临床医生了解并掌握参考限值范围,这样才能避免由于限值不同给工作带来的影响。
三、选择理想的淀粉酶测定方法IFCC(国际临床化学学会)提出理想的AM Y 测定方法要符合下述几个条件〔2〕:(1)符合零级反应动力学的连续监测法;(2)底物和反应物具有确定的结构,产物的组成因时间、条件的变化而变化;(3)反应产物之一应是具有恒定吸光系数的指示产物,测定条件的轻度偏离对吸光系数的影响不大;(4)酶的转换率高,即在该反应体系中,底物 产物有较高的速度,从而有一定的灵敏度;(5)延滞期小于3min;(6)不受内源性葡萄糖的干扰;(7)测定的线性应达到正常参考值上限的5倍;(8)是直接测定法,不需要用偶联工具参加反应。
米氏常数的测定
⽶⽒常数的测定底物浓度对酶促反应速度的影响——⽶⽒常数的测定⼀．⽬的要求1.1了解底物浓度对酶促反应的影响。
1.2掌握测定⽶⽒常数K m 的原理和⽅法。
⼆．实验原理酶促反应速度与底物浓度的关系可⽤⽶⽒⽅程来表⽰：式中：v ——反应初速度（微摩尔浓度变化/min ）；V ——最⼤反应速度（微摩尔浓度变化/min ）； [s]——底物浓度（mol/L ）； K m ——⽶⽒常数（mol/L ）。
这个⽅程表明当已知K m 及V 时，酶促反应速度与底物浓度之间的定量关系。
K m 值等于酶促反应速度达到最⼤反应速度⼀半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之⼀。
不同的酶，K m 值不同，同⼀种酶与不同底物反应K m 值也不同，K m 值可以近似地反应酶与底物的亲和⼒⼤⼩：K m 值越⼤，表明亲和⼒⼩；K m 值⼩，表明亲和⼒⼤。
则测K m 值是酶学研究的⼀个重要⽅法。
⼤多数纯酶的K m 值在0.01～100mmol/L 。
Linewaeaver-Burk 作图法（双倒数作图法）是⽤实验⽅法测K m 值的最常⽤的简便⽅法：实验时可选择不同的[s]，测定对应的v ，以对作图，得到⼀个斜率为V Km的直线，其截距][1s 则为mK 1，由此可求出K m 的值（截距的负倒数）。
本实验以胰蛋⽩酶消化酪蛋⽩为例，采⽤Linewaeaver-Burk 双倒数作图法测定双倒数作图法。
胰蛋⽩酶催化蛋⽩质中碱性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键⽔解。
⽔解时有⾃由氨基⽣成，可⽤甲醛滴定法判断⾃由氨基增加的数量⽽跟踪反应，求得初速度。
][][s K s V v m +=V s V K v m 1][1.1+=v 1][1s三．试剂和器材3.1 试剂A.10～30g/L的酪蛋⽩溶液（pH8.5）：分别取10、20、25、30g酪蛋⽩溶于约900mL⽔中，加20mL 1mol/L NaOH 连续振荡，微热直⾄溶解，以1mol/L HCl 或1mol/L NaOH调pH⾄8.5，定容1L，即⽣成四种不同[s]的酪蛋⽩标准溶液。
淀粉酶的测定方法
淀粉酶的测定方法
淀粉酶的测定方法主要有以下几种：
1. 碘遇法：将待测样品与含有淀粉的试液反应，然后加入碘溶液，观察颜色变化。
淀粉酶能催化淀粉水解产生葡萄糖，当样品中有淀粉酶存在时，反应液中淀粉的含量减少，碘反应呈现淡黄色。
通过比较反应前后颜色的变化程度，可以间接测定淀粉酶的活性。
2. 滴定法：采用淀粉为底物，测定反应液中葡萄糖的含量。
首先将待测样品加入含有淀粉的试液中，然后根据反应的程度，利用滴定法以还原糖作为指示剂测定反应液中葡萄糖的含量，从而计算淀粉酶的活性。
3. 导电度法：利用淀粉酶对淀粉的水解反应产生的葡萄糖使反应液的导电度发生变化来测定淀粉酶的活性。
测定时先将反应液的导电度测定为A，然后加入淀粉酶，反应一段时间后导电度测定为B，根据B-A的差值可以计算淀粉酶的活性。
4. 比色法：利用淀粉酶对淀粉的水解反应产生的葡萄糖与某种试剂发生比色反应，通过测定反应液的吸光度来间接测定淀粉酶的活性。
常用的比色试剂包括间苯三酚、邻苯二酚等。
需要注意的是，不同测定方法的适用范围和操作步骤可能会有所不同，具体选择
哪种方法取决于实验目的和样品特点。
α-淀粉酶动力学常数的测定
实验三α-淀粉酶动力学常数的测定一、实验背景及目的α-淀粉酶，系统名称1,4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶，别名为液化型淀粉酶、液化酶、α-1，4-糊精酶，可以水解淀粉内部的α-1,4-糖苷键，水解产物为糊精、低聚糖和单糖。
在酶促反应动力学中，以最简单的无别构中心的酶（后称米氏酶）展开合理分析，建立米氏公式，由米氏公式得到了与酶本质相关的两个最重要的动力学常数K m和 V max。
【1】对α-淀粉酶水解淀粉的测定，可通过生成麦芽糖的浓度来确定α-淀粉酶的最大反应速度和米式常数Km的值。
进而了解米式常数在动力学研究的意义，了解K m和V max的常用测定方法以及原理，利用双倒数作图法学习掌握α-淀粉酶米式常数和Vmax的测定步骤。
【2】二、实验原理当底物浓度在较低浓度增加时，酶促反应速度随着底物浓度的增加而迅速增加。
当底物增至一定浓度后，即使再增加其浓度，反应速度也不会增加很快。
这是由于酶浓度限制了所形成的中间络合物浓度的缘故，这时反应速度与底物的浓度无关，是零级反应。
米氏方程的推导:【3】【4】【6】【7】K1([Et]-[ES])[S]=K2[ES]+K3[ES]整理得:（2）令：（米氏常数）则（2）变为([Et]-[ES])[S]=K m[ES] 整理得：（3）将（3）代入（1）得（4）当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即[Et]=[ES]，反应达到最大速度V max=K3[ES]=K3[Et] （5）将（5）代入（4）得米氏方程式：K m值的推导：当反应速度为最大反应速度一半时得 K m=[S]K m值的含义：[11]①K m是酶的特征性常数之一，与酶的性质有关，与酶的浓度无关②K m可近似表示酶对底物的亲和力③同一酶对于不同底物有不同的K m值，可判断最适底物浓度。
K m值与V max值的测定：【9】【10】【11】【12】三、实验材料、仪器和试剂1.仪器：722型可见光分光光度计、恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）、沸水浴锅、微量移液器2.试剂：（1）4 U/ml的α-淀粉酶溶液（2）pH 5.0柠檬酸缓冲液（3）1%淀粉溶液（4）1 mg/ml麦芽糖溶液（5）0.4M NaOH溶液（6）3，5-二硝基水杨酸四、实验步骤：取13支平口试管，按下表进行操作：表1.不同底物浓度下的酶促反应体系制作取7支15 ml刻度试管，按下表进行操作：五、数据整理及结果计算图1.标准曲线OD520由标准曲线：y=0.5679x，即A=0.5679C（其中A为吸光度，C为麦芽糖浓度）将不同浓度底物OD值代入其中得对应麦芽糖浓度C。
纯化后的α-淀粉酶米氏常数的测定
0.05 20 1 0 1 5 1 10 2 5 25
0.1 10 1 1 1 5 1 10 2 5 25
0.15 6.67 1 2 1 5 1 10 2 5 25
0.20 5.0 1 3 1 5 1 10 2 5 25
0.25 4.0 1 4 1 5 1 10 2 5 25
0.30 3.33 1 5 1 5 1 10 2 5 25
0.35 2.86 1 6 1 5 1 10 2 5 25
0.40 2.5 1 7 1 5 1 10 2 5 25
方法步骤
4、各取1ml预热5分钟（温度以最适反应温度） 5、加入1ml稀释好的酶液，混匀后，保温反应 10分钟 6、反应结束后加入2mL DNS试剂，沸水浴显 色5分钟，冷却后定容至25mL 7、540nm比色测定OD值 8、根据OD540和回归方程计算相应麦芽糖的量 （mg），再计算出反应速度（V）及1/V 9、利用双倒数作图法（或称为LineweaverBurk作图法）求出Km和Vmax。利用1/[S] 和1/V进行直线回归，根据截距=1/Vmax；斜 率=Km/Vmax分别计算出Vmax、Km。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ作表
1/[S] 底物浓度（mg/mL） 20mg/mL马铃薯淀粉溶液用量（mL） 缓冲液用量（mL） 配制好的底物吸取量（mL） 水浴预热时间（min） 加入稀释好的酶液（mL，预热） 保温反应时间（min） 加入DNS试剂（2mL） 沸水浴时间（min） 冷却定容（mL） OD540 计算求出麦芽糖的含量（mg） 计算出反应速度V（mg/min） 1/V
Vmax [S] V Km [S]
利用不同底物浓度（[S]），在一定条件下，测 定其酶促反应速度（V）； 将米氏方程由双曲线转变为直线方程，再通过相 应作图法，求出Km和Vmax。
实验七 淀粉酶动力学分析
实验七 淀粉酶动力学分析（Ⅱ）——淀粉酶解米氏常数测定与阿卡波糖竞争性抑制动力学计算（4学时）第四部分 α-淀粉酶K m 值的测定一、实验目的了解并掌握米氏常数的意义和测定方法。
二、实验原理当底物浓度在较低浓度增加时，酶促反应速度随着底物浓度的增加而迅速增加。
当底物增至一定浓度后，即使再增加其浓度，反应速度也不会增加很快。
这是由于酶浓度限制了所形成的中间络合物浓度的缘故。
Michaelis 和Menten 推导得出底物浓度和酶促反应速度的关系式为：][][max S K S V m +=υ此式称为米氏方程，式中：υ为反应速度，即每升反应体系中每分钟形成葡萄糖的摩尔数（mol/（L·min ））；m ax V 为最大反应速度（mol/（L·min ））；][S 为底物浓度，此实验以反应体中淀粉中葡萄糖残基的摩尔浓度表示（mol/L ），注意！应以反应体系总体积计算底物浓度，如淀粉溶液浓度为1%，反应体系中有3 mL 淀粉溶液和1 mL 淀粉酶液，则淀粉底物浓度应为：[]=+⨯=13316210S 0.0463 mol/L 10——1%的淀粉溶液浓度为10 g/L 180——淀粉中的葡萄糖残基的分子量 3——反应体系中1%淀粉溶液的体积（mL ） 1——反应体系中α-淀粉酶的体积（mL ）m K 为米氏常数，单位与底物浓度相同（mol/L ）。
按此方程，可用作图法求出m K ，常用的方法为双倒数作图法。
取米氏方程的倒数，以υ1对][1S 作图：maxmax 1][11V S V K m +=υ得一直线，其斜率为m ax V K m ，截距为m ax1V ，求出m K 。
三、实验器材与试剂实验器材1-16. 见实验七第一部分17. 化学试剂：见实验七第二部分 实验试剂1. pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液2. 1%淀粉溶液：称取1 g 可溶性淀粉的200 mL 烧杯中，用5 mL pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液调成糊状。
六、脲酶米氏常数简易测定2010(精)
米氏常数的意义
• 由米氏方程可知，当反应速度等于最大反应速度一半时, 即V = 1/2Vmax时, Km = [S] 。 • 上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物 浓度。 • 因此,米氏常数的单位为mol· L-1。 • 不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常 数。 • Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的 缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。 • Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度 小，酶的催化活性低; Km值小表示亲和程度大,酶的催化 活性高。 • 通过Km值的测定，可鉴定酶的各种底物，Km值最小者为酶 最佳底物，即天然底物。
充分摇匀，室温下静置5min，过滤，另取5支试管，同上编号，加入以下试剂 滤液（ml） 双蒸水（ml） 显色液（ml） 1 2 0.75
迅速摇匀，用分光光度计在420nm下测定各管A值。
4.2 数据处理
• 各管在420nm测定OD420nm值。 • 由于光密度（OD420nm）与显色，显色与底物浓度成正比， 反应时间均为15min。故以1/A取代1/V为纵坐标作图。 • 测定所用单位为Km单位g· L-1 。 • 由1/A对1/[S]作图，求得回归方程，计算α-淀粉酶催化 可溶性淀粉溶解的米氏常数Km。
V max [ S ] V Km [ S ]
• 其中，V为酶促反应速度；Vmax为最大反应反应速度（与V 的单位相同, mol· L-1· min-1）； [S]为底物浓度（mol· L-1）； Km为米氏常数，是酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一 半时的底物浓度,即V = 1/2Vmax时, Km = [S] 。 • 在酶促反应中，底物在低浓度情况下，反应相对于底物是 一级反应（first order reaction）；而当底物浓度处于 中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应（mixed order reaction）；当底物浓度增加时，反应由一级反应 向零级反应（zero order reaction）过渡；当底物浓度[S] 逐渐增大时，速度V相对于[S]的曲线为一双曲线。下图为 米氏方程的模拟作图：
淀粉酶活性测定实验报告(完整版)
报告编号：YT-FS-2637-32淀粉酶活性测定实验报告(完整版)After Completing The T ask According To The Original Plan, A Report Will Be Formed T o Reflect The Basic Situation Encountered, Reveal The Existing Problems And Put Forward Future Ideas.互惠互利共同繁荣Mutual Benefit And Common Prosperity淀粉酶活性测定实验报告(完整版)备注：该报告书文本主要按照原定计划完成任务后形成报告，并反映遇到的基本情况、实际取得的成功和过程中取得的经验教训、揭露存在的问题以及提出今后设想。
文档可根据实际情况进行修改和使用。
淀粉酶活性的测定一、研究背景及目的酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应的活性蛋白，几乎所有的生化反应都离不开酶的催化，所以酶在生物体内扮演着极其重要的角色，因此对酶的研究有着非常重要的意义。
酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。
酶活力由酶活力单位表征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称，按照其水解淀粉的作用方式，可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶等。
α-淀粉酶和β-淀粉酶是其中最主要的两种，存在于禾谷类的种子中。
β-淀粉酶存在于休眠的种子中，而α-淀粉酶是在种子萌发过程中形成的。
α-淀粉酶活性是衡量小麦穗发芽的一个生理指标,α-淀粉酶活性低的品种抗穗发芽,反之则易穗发芽。
目前,关于α-淀粉酶活性的测定方法很多种,活力单位的定义也各不相同,国内外测定α-淀粉酶活性的方法常用的有凝胶扩散法、3 ,5-二硝基水杨酸比色法和降落值法。
这3 种方法所用的材料分别是新鲜种子、萌动种子和面粉,获得的α-淀粉酶活性应该分别是延二、实验原理萌发的种子中存在两种淀粉酶，分别是α-淀粉酶和β-淀粉酶，β-淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6下则发生钝化。
测定淀粉酶活性的两种方法的比较研究
测定淀粉酶活性的两种方法的比较研究一、简述淀粉酶是一种能够催化淀粉分解为糖类物质的生物催化剂，其在食品工业、生物塑料生产以及医药等领域具有广泛的应用价值。
为了更好地了解和评估淀粉酶的活性，本研究将比较分析两种常用的测定淀粉酶活性的方法：碘量法和比浊法。
该方法系通过加入碘与淀粉样液来测量淀粉的水解程度，但是它无法避免一些还原性物质的干扰。
比浊法是基于酶反应产生胶体体系的形成，据此原理可测定淀粉酶活力。
本实验旨在比较这两种方法在测定淀粉酶活性时的优缺点，并分析其可能的原因，以期找到一种更为理想和高效的测定手段。
1. 淀粉酶的简介及重要性淀粉酶是一种能够催化淀粉分解为糖类物质的生物催化剂，它在食品工业、发酵工业以及生物塑料工业等领域具有广泛的应用。
淀粉酶的活性是衡量其性能的重要指标，催化效率越好。
研究淀粉酶活性的方法对于这些行业的发展具有重要意义。
淀粉酶在食品工业中扮演着关键角色。
在制作面条、饼干等食品时，需要确保食品中的淀粉得到充分分解，从而提高食品的口感和品质。
淀粉酶能够有效分解淀粉，使其转化为糖类物质，为食品提供甜味和黏性，因此它是食品工业中不可或缺的酶制剂。
淀粉酶在发酵工业中也有重要应用。
发酵工程中常用的糖化酶就是一种淀粉酶，它能够将淀粉转化为葡萄糖，为微生物提供能量和生长所需的碳源。
通过使用不同类型的淀粉酶，可以对不同种类的微生物进行定向发酵，生产出各种有用的产品，如抗生素、酶制剂等。
淀粉酶在生物塑料工业中也有潜在的应用前景。
生物可降解塑料是一种环保型的生物塑料，其降解过程需要淀粉酶的参与。
通过利用淀粉酶降解塑料中的淀粉成分，可以降低塑料对环境的污染，为实现可持续发展提供新的途径。
淀粉酶在各个领域都具有重要的应用价值。
研究淀粉酶活性的方法，对于推动相关领域的技术进步和产业发展具有重要意义。
2. 淀粉酶活性测定的方法和目的在淀粉酶活性的研究中，有多种方法可用于测定酶活力。
本部分将详细介绍两种常见的淀粉酶活性测定方法：碘量法和比色法，并阐述它们的目的。
淀粉酶米氏常数测定(1)
瓶号 试剂 4%可溶性淀粉（ml） H2O(ml) 缓冲液(ml)
1 0.5 3.5 0.75 0.25
2 1 3 0.75 0.25
3 1.5 2.5 0.75 0.25
4 2 2 0.75 0.25
5 2.5 1.5 0.75 0.25
6 3 1 0.75 0.25
蒸馏水(ml)
充分摇匀，60℃放置10min 加入3.0ml的0.2moL/L HCl，摇匀 取出1.0ml浓度梯度吸光度
不同底物浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、 3.0%）的可溶性淀粉4ml，加入缓冲液0.75ml和蒸馏水 0.25ml，充分摇匀，60℃放置10min，立即加入3.0ml的 0.2moL/L HCl终止反应，然后立即取出1.00ml溶液置于 5.00ml稀碘液摇匀，显色，并以稀碘液作对照，于 660nm处测定吸光度（按操作表1操作）
瓶号 试剂 4%可溶性淀粉（ml） H2O(ml) 缓冲液(ml)
1 0.5 3.5 0.75
2 1 3 0.75
3 1.5 2.5 0.75
4 2 2 0.75
5 2.5 1.5 0.75
6 3 1 0.75
60℃放置，预热5min
酶液(ml)
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
充分摇匀，60℃放置10min 取出，加入3.0ml的0.2moL/L HCl 取出1.0ml溶液置于5.00ml稀碘液，显色 A660 可溶性淀粉量浓度% [s] 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
（5）0.02mLpH6.0磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液 称取磷酸氢 二钠(Na2HPO4.12H2O)45．23g和柠檬酸(C6H8O7·2O)8.07g， H 用蒸馏水溶解，用酸度计或pH试纸校正pH，定容至1000 mI。 （6）0.2moL/L HCl 取36%盐酸（饱和浓盐酸）0.86ml加入已加有少量蒸馏水 的50ml容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀即可。
淀粉酶(AMY)测定标准操作程序SOP文件
S.VOLUME(NORMAL) [ 7 ]
SD LIMIT [ 0.1 ]
S.VOLUME(DECREASE) [ 2 ]
SENSITIVITY LIMIT(LOW) [ -99999 ]
S.VOLUME(INCREASE) [ 14 ]
SENSITIVITY LIMIT(HIGH) [ 99999 ]
ABCD医院
生化实验室
文件编号：
ABCD-SOP-04-07
淀粉酶（AMY）测定
版序：ABCD
页码：第4页，共4页
AMY参数设置表
TEST NAME [ AMYL ]
R.VOLUME(R4) [ 0 ]
TEST CORD [ 570 ]
ABSORBANCE LIMIT [ 20000/DECREASE ]
-淀粉酶分为两种：即胰腺型（P-AMY）和唾液型（S-AMY），而胰腺型淀粉酶的检测对于诊断胰腺炎更有绝对意义，具有器官特异性。唾液型可以有许多片断产生，可以在唾液、泪液、汗液、母乳、羊水、肺、睾丸及输卵管中存在。胰腺型淀粉酶的检测适用于急性胰腺炎及慢性胰腺炎急性发作时的诊断以及监测治疗。因其灵敏度及特异性均较高，胰腺型淀粉酶的诊断值可以与酯酶相似。在急性胰腺炎的诊断中，检测胰腺淀粉酶比总淀粉酶的灵敏度高38％。
ABCD医院
生化实验室
文件编号：
ABCDห้องสมุดไป่ตู้SOP-04-07
淀粉酶（AMY）测定
版序：ABCD
页码：第2页，共4页
4.3质控物
来源：Precinorm (罗氏正常值质控)
Precipath (罗氏病理值质控)
其它适合的质控品
米氏常数测定方法
酶活米氏常数实验一、实验前准备1、24孔板洗净烘干，准备足够枪头。
2、准备催化剂，在光下呈透明状为分散性较好，否则用超声清洗器（位于化学间）超声分散5min，期间准备底物（如TMB或者ABTS），浓度依照自己实验的要求定（10mg/mL 或5mg/mL），一般1mL足够用，可在1.5mL离心管中溶解。
TMB（外间冰箱上层）溶于DMSO（二甲亚砜，位于化学间王春雨的柜子里），ABTS（与TMB放在一起）溶于二次水。
3、将缓冲液、催化剂、底物、H2O2、200µL和10µL移液枪、50µL排枪（位于称量处上方模拟酶专用枪的柜中）、96孔板、24孔板、卷纸一起放入纸盒中，放到对面酶标仪前，开空调定室温（25℃，提醒其他人随手关门），24孔板中其中一排加入适量H2O2（每孔1mL 左右，注意避光，可在板上盖一张卷纸），将缓冲液、催化剂、底物放实验台上，静置0.5-1h。
4、记录本上提前写好实验的加样顺序：催化底物TMB（或ABTS）的酶促动力学过程加样顺序：①200µL缓冲液②10µL催化剂③底物TMB（ABTS）(0，0.5，1，2，4，6，8，10µL) ④32µLH2O2（排枪加）催化底物H2O2的酶促动力学过程加样顺序：①200µL缓冲液②10µL催化剂③H2O2（2，4，6，8，10，16，32，64µL）④10µL底物TMB（ABTS）（排枪加）数据记录按下表记，Code为每次读板时的微孔板编号，Time为对应的读板时的时间，一般30s读板一次，可根据反应的快慢来确定读板的时间。
Code 1 2 3 4 5 6 7TimeTMB 0 0.5 1 2 4 6 8 10V01Code 1 2 3 4 5 6 7TimeH2O2 2 4 6 8 10 16 32 64V01二、实验1、打开酶标仪（开关在仪器后部，若仪器没反应，请检查电源是否接通），密码为5个0，按Enter键进入系统。
淀粉酶米氏常数的测定
实验二 淀粉酶米氏常数的测定一、目的要求了解底物浓度与酶反应速度之间的关系，学习和掌握米氏常数（Km ）及最大反应速度（Vm ）的测定原理和方法，测出淀粉酶在以对淀粉为底物时的Km 和Vm 值。
二、原理酶促反应v-[S]曲线推导出米氏方程为：其中[S]为底物浓度；v 为初速度；Vm 为最大反应速度；Km 为米氏常数。
米氏常数Km 是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。
][][S K S V v m m+=特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km 往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。
测定Km 和Vm ，可通过作图法求得。
最常用的Lineweaver-Burk 双倒数作图法。
这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：以1/v 对1/[S]作图，可得一条直线，所得直线的截距是1/Vm ，斜率为Km/ Vm 。
通过Lineweaver-Burk 作图法作图后可方便的求出Km 值。
三 实验材料、仪器和试剂1．实验材料淀粉酶购自国药集团医药有限公司。
精确称取酶制剂0.1g(以大约2000 U ／g 计)，先用少量40℃蒸馏水溶解、浸提。
将上层液小心倾入500ml 容量瓶内，沉m m m V S V K v 1][11+⋅=淀再加水捣研。
如此重复，最后全部移入容量瓶中，定容后摇匀，用四层纱布过滤，滤液供测试定用。
2．仪器比色管，试管25 mm×200 mm，平头移液管(可用磨去尖头的2mL移液管制)；刻度吸管5mI—(X1)，移液管20 mI；秒表，吸耳球(×1)，电热恒温水浴锅，721型分光光度计。
3．试剂(1)原碘浓称取碘11 g，碘化钾(KI)22 g，先用少量蒸馏水使碘—碘化钾完全溶解，定容至500 mL，贮于棕色瓶内。
(2)稀碘液取原碘液2mL，加碘化钾20 g，用蒸馏水定容至500 mL．贮于棕色瓶内。
(3)4％可溶性淀粉精确称取可溶性淀粉4.000g（精确至0.001g），用少量蒸馏水调匀。
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三 仪器和试剂
试剂
（1）酶液：精确称取酶制剂0.1g(以大约2000 U／g计)，先用少量40℃ 蒸馏水溶解、浸提。将上层液小心倾入500ml容量瓶内，沉淀再加水 捣研。如此重复，最后全部移入容量瓶中，定容后摇匀，用四层纱布 过滤，滤液供测试定用
（2）原碘液 称取碘11 g，碘化钾(KI)22 g，先用少量蒸馏水使碘-碘化 钾完全溶解，定容至500 mL，贮于棕色瓶内。
试剂
瓶号
1
2
3
4
5
6
4%可溶性淀粉（ml） 0.5
1
1.5
2
2.5
3
H2O(ml) 缓冲液(ml)
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75
60℃放置，预热5min
酶液(ml)
0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
充分摇匀，60℃放置10min
1 Km 1 1 v Vm [S] Vm
酶促反应v-[S]曲线
以1/v对1/[S]作图，可得一条直 线，所得直线的截距是1/Vm， 斜率为Km/ Vm。通过 Lineweaver-Burk作图法作图后 可方便的求出Km值。
三 仪器和试剂
试管 移液抢 秒表 吸耳球 恒温水浴锅 7200型分光光度计。
一、 实验目的
了解并掌握米氏常数的意义和测定方法
二、 实验原理
推导出米氏方程为： v Vm[S ] Km [S]
米氏常数Km是酶的一个基本特征常 数，它包含着酶与底物结合和解离的 性质。特别是同一种酶能够作用于几 种不同底物时，米氏常数Km往往可以 反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。
测定Km和Vm，可通过作图法求得 。 最常用的Lineweaver-Burk双倒数 作图法。这个方法是将米氏方程转化 为倒数形式，即：
（3）稀碘液 取原碘液2mL，加碘化钾20 g，用蒸馏水定容至500 mL．贮于棕色瓶内。
（4）4％可溶性淀粉 精确称取可溶性淀粉4.000g（精确至0.001g）， 用少量蒸馏水调匀。边搅拌边加入煮水70mL，加热煮沸至透明，冷却 后定容至100 mL, 此溶液现配现用。
（5）0.02mLpH6.0磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液 称取磷酸氢 二钠(Na2HPO4.12H2O)45．23g和柠檬酸 (C6H8O7·H2O)8.07g，用蒸馏水溶解，用酸度计或pH试纸 校正pH，定容至1000 mI。
（6）0.2moL/L HCl
取36%盐酸（饱和浓盐酸）0.86ml加入已加有少量蒸馏水 的50ml容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀即可。
四、实验操作
1. 淀粉浓度梯度吸光度
不同底物浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、 3.0%）的可溶性淀粉4ml，加入缓冲液0.75ml和蒸馏 水0.25ml，充分摇匀，60℃放置10min，立即加入 3.0ml的0.2moL/L HCl终止反应，然后立即取出 1.00ml溶液置于5.00ml稀碘液摇匀，显色，并以稀碘 液作对照，于660nm处测定吸光度（按操作表1操作）
计算Km值。
五、实验注意事项
取液量一定要准确。 反应时间一定要精确。 加酶前后一定要将试剂混匀。 分光光度计的正确使用。 取液器的使用
六、思考题
(1) 试说明米氏常数Km的物理意义和生物学意义。 (2)为什么说米氏常数Km是酶的一个特征常数而Vm则不是？
取出，加入3.0ml的0.2moL/L HCl
取出1.0ml溶液置于5.00ml稀碘液，显色
A660
可溶性淀粉量浓度% 0.5
1[s]
1/[s]
v
1/v
3. 数据处理与作图
酶的反应速度V：以单位时间内吸光度的减少量d(A0-A1)／ dt来表示
以1/v 对1/[S]双倒数法作图
试剂
瓶号
1
2
3
4
5
6
4%可溶性淀粉（ml） 0.5
1
1.5
2
2.5
3
H2O(ml) 缓冲液(ml)
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75
蒸馏水(ml)
0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
充分摇匀，60℃放置10min
加入3.0ml的0.2moL/L HCl，摇匀
取出1.0ml溶液置于5.00ml稀碘液显色
A660
2. Km测定
不同底物(可溶性淀粉)浓度（0.5%、1.0%、 1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）可溶性淀粉 4mL，缓冲液0.75mL，摇匀后，在60℃水浴 中平衡5 min，加入0.25 mL稀释好的酶液， 立即记时，充分摇匀，准确反应10 min，立 即加入3.0ml的0.2moL/L HCl终止反应，然后 立即取出1.00ml溶液置于5.00ml稀碘液显色， 摇匀，并以稀碘液作对照，于660nm处测定 吸光度（按操作表2操作）。