检测方法的确认和验证
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检测方法确认和验证
• 4.5.14 检验检测机构应建立和保持检验检测方法控制程 序。检验检测方法包括标准方法、非标准方法（含自制 方法）。应优先使用标准方法，并确保使用标准的有效 版本。在使用标准方法前，应进行证实。在使用非标准 方法（含自制方法）前，应进行确认。检验检测机构应 跟踪方法的变化，并重新进行证实或确认。必要时检验 检测机构应制定作业指导书。如确需方法偏离，应有文 件规定，经技术判断和批准，并征得客户同意。当客户 建议的方法不适合或已过期时，应通知客户。 • 非标准方法（含自制方法）的使用，应事先征得客户同 意，并告知客户相关方法可能存在的风险。需要时，检 验检测机构应建立和保持开发自制方法控制程序，自制 方法应经确认。
稳定性
• 在测定的浓度下，设置不同的时间段进行 测定，经过实验证明样品稳定的时间。
耐用性
• 方法应具有对可变试验因素的抗干扰能力，当测定条件发生细 小变动时，方法应具有一定的保持测定结果不受影响的承受程 度。并给出平行两次测定的允差。 • 例如，分析中的样品性质、 • pH值、温度、所用试剂品种及使用量、人员等分析条件在适当 的范围内改变时，对测定值的稳定性进行的研究结果。其中， 试样性质是需要重点考虑的内容之一，任何一种方法都有其试 样适应范围，能否针对某种试样采用该分析方法需要经过严格 的验证，技术参数符合要求时方可采用，并形成相应的报告。 • 不同的色谱柱、试剂批号和牌号之间存在着一定的差别，这些 差别可能直接会影响到结果的准确与否，因此当改变上述内容 时均需要进行验证性实验并形成相应的报告。对于色谱柱还应 确定拖尾因子、分离度、容量因子、塔板数等指标。
• 1、检验检测机构应建立和保持检验检测方法控制 程序。检验检测机构应使用适合的方法（包括抽样 方法）进行检验检测，该方法应满足客户需求，也 应是检验检测机构获得资质认定许可的方法。查： 是否建立和保持使用适合的检验检测方法和方法确 认的程序； • 2、检验检测方法包括标准方法和非标准方法，非 标准方法包含自制方法。 • 3、当客户指定的方法是企业的方法时，则不能直 接作为资质认定许可的方法，只有经过检验检测机 构转换为其自身的方法并经确认后，方可申请检验 检测机构资质认定。
• 7、偏离指一定的允许范围、一定的数量和一定的 时间段等条件下的书面许可。检验检测机构应建立 允许偏离方法的文件规定。不应将非标准方法作为 方法偏离处理。查：方法偏离是否同时满足：有方 法偏离文件规定和经技术判定不影响结果、经批准 和客户同意四个条件，实施方法偏离时，是否保留 记录。 • 8、当客户建议的方法不适合或已过期时，应通知 客户。如果客户坚持使用不适合或已过期的方法时， 检验检测机构应在委托合同和结果报告中予以说明， 应在结果报告中明确该方法获得资质认定的情况。 查查：客户建议的检验检测方法不适当时，机构是 否通知客户，是否有必要的记录。
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检测限、定量下限测定低限（主成 分测定可不需要）
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把3倍空白值的标准偏差（测定次数n≥20）相对应的质量或浓度称为检出限。方法的测定低限按式（2）计 算: CL=3Sb/b （2） 式中: CL—方法的测定低限; Sb—空白值标准偏差(一般平行测定20次得到); b—方法校准曲线的斜率。 色谱法（GC、HPLC） 设：色谱仪最低响应值为S=3N（N为仪器噪音水平），则检出限按式（3）进行计算。检出限=最低响应值 /b = S/b （3） 式中： b——标准曲线回归方程中的斜率，响应值/μg 或响应值/ng；S——为仪器噪音的3倍，即仪器能辨认的最小 的物质信号。 7.5.2吸光法和荧光法 按国际理论与应用化学家联合（IUPAC）规定。 全试剂空白响应值按式（4）进行计算。XL =平均值+Ks （4） 式中： XL——全试剂空白响应值（除不加试样外，采用完全相同的分析步骤、试剂和用量（滴定法中标准滴定液的 用量除外），进行平行操作所得的结果。 平均值——测定n次空白溶液的平均值（n≥20）； s——n次空白值的标准偏差； K——根据一定置信度确定的系数。 对于已制定MRL的物质，方法测定低限加上样品在MRL处的标准偏差的三倍，不应超过MRL值。对于禁用物 质，方法测定低限应尽可能低。
比较
证实 对象
目的
确认 非标方法
是否使用
偏离 标准、非标
临时使用、非 常态 技术判定（一 定误差范围内、 一定的数量、 一定的时间段）
标准方法
是否有能力按照标准 方法展开检测校准工 作 从“人机料法环测” 去证明
方法
用五种方法来 确认或组合
源自文库
时限
使用一段时间
在转化为标准 方法前
偏离后仍需回 归常态
• 确认应是以下五种中的一种或组合，是成 本、风险和技术可行性的一种平衡（不确 定度、检出限、方法的选择性、线性、重 复性、稳健度、基体干扰等） • 1、使用参考标准或参考物质；2与其他方 法比较；3、实验室间比对；4、对影响结 果因素系统评价；5、不确定度的评定 • 保留确认和验证记录
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标准（工作）曲线
• 应描述校准曲线的数学方程以及校准曲线 的工作范围，浓度范围尽可能覆盖一个数 量级，至少作5个点(不包括空白)。相关系 数（r）不应低于0. 99，测试溶液中被测组 分浓度应在校准曲线的线性范围内。 • 回归方程的计算在绘制标准曲线时，可用 直线回归方程式计算，然后根据计算结果 绘制。用最小二乘法计算直线回归方程的 公式y=a+bX。
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4、检验检测机构在初次使用标准方法前，应证实能够正确地运用这些标准方 法。如果标准方法发生了变化，应重新予以证实，并提供相关证明材料。查： （1）检验检测报告是否使用检验检测标准的有效版本。（2）方法使用前是 否进行验证，保留方法验证记录，以证实检验检测机构能有效使用这些方法。 5、检验检测机构在使用非标准方法前应进行确认，以确保该方法适用于预期 的用途，并提供相关证明材料。查：非标准方法（含自制方法）使用前是否 经确认，方法变更后是否重新进行确认，保留确认和验证记录。如果方法发 生了变化，应重新予以确认，并提供相关证明材料。查方法变更后是否进行 验证，保留方法验证记录，以证实检验检测机构能有效使用这些方法。 6、如果标准、规范、方法不能被操作人员直接使用，或其内容不便于理解， 规定不够简明或缺少足够的信息，或方法中有可选择的步骤，会在方法运用 时造成因人而异，可能影响检验检测数据和结果正确性时，则应制定作业指 导书（含附加细则或补充文件）。 查：是否制定必要的作业指导书，查证作业指导书目录，审核其内容是否满 足要求。 查：核查检验检测细则（或作业指导书）是否满足要求。（必要时，细化标 准要求）
准确度
• 重复分析标准物质(实物标样)或水平测试样品，测 定含量(经回收率校正后)平均值与真值的偏差指导 范围见表3。 • 表3测定值与真值的偏差指导范围 • 真值含量/(mg/kg) 偏差范围/% • <0 .001 -50~+20 • 0 .001~0.01 -30~+10 • 0 .010~10 -20~+10 • l0~1000 <15 • 1000~10000 <10 • 10 000 <5
回收率
• 回收率是在没有标准物质情况下，测定的平均值与真值相符的程度。应在标 准值点、标准值点的上下20%，或标准曲线内的高中低进行三水平试验，或 在方法测定低限、两倍方法测定低限和十倍方法测定低限进行三水平试验;对 于已制定最高残留限量(MRL)的，回收率应在方法测定低限、MRL、选一合适 点进行三水平试验;对于未制定MRL的，回收率应在方法测定低限、常见限量 指标、选一合适点进行三水平试验。 用回收率表示方法，加入的标准物质的回收率按式（1）进行计算。 P= （x1-x2）/m （1） 式中：P——加入的标准物质的回收率；m——加入的标准物质的量；X1—— 加标试样的测定值；X2——未加标试样测定值。回收率的参考范围见表2。 表2回收率范围 被测组分含量/(mg/kg) 回收率范围/% >100 95-105 1-100 90-110 0. 1-1 80-110 <0. 1 60一120
精密度
• 同一样品的各测定值的符合程度为精密度。精密度试验值应在标准值点或 ±20%，或标准曲线内的高中低三水平试验值内。对于已制定MRL的，精密度 实验应在方法测定低限、MRL、选一适合点三个水平进行；对于未制定MRL的， 精密度实验应在方法测定低限、常见限量指标中选一适合点三个水平进行。 重复测定次数至少为6。实验室内部的变异系数参考范围见表3。 在某一实验室，使用同一操作方法，测定同一稳定样品时，允许变化的因素 有操作者、时间、试剂、仪器等，测定值之间的相对偏差即为该方法在实验 室内的精度。 表3实验室内变异系数(CV)/% 被测组分含量 CV% 被测组分含量 CV% 0. 1μg/kg 43 100 mg/kg 5. 3 1μg/kg 30 1 000 mg/kg 3. 8 10μg/kg 21 1% 2. 7 100μg/kg 15 10% 2. 0 1 mg/kg 11 100% 1. 3 10 mg/kg 7. 5
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9、检验检测机构应制定程序规范自己制定的检验检测方法的设计开 发、资源配置、人员、职责和权限、输入与输出等过程，自己制定的 方法必须经确认后使用。 • 查：非标准方法的使用，是否与客户达成协议。协议中是否包括能否 满足客户要求的说明。 • 查：非标准方法（含自制方法）的使用，事先征得客户同意，并告知 客户相关方法可能存在的风险等情况记录。 • 在方法制定过程中，需进行定期评审，以验证客户的需求能得到满足。 使用自制方法完成客户任务时，需事前征得客户同意，并告知客户可 能存在的风险。查：检验检测机构应建立和保持开发自制方法控制程 序（无参照方法情况）， • 查：是否有自定方法，是否是有计划及指定有资格经验的人员进行该 项工作（查人员要求）。 • 查：是否进行方法的可靠性确认和验证、规定方法的评价和使用等。 是否实施受控管理并保存记录。
检测方法的研究验证
• 参照《实验室质量控制规范 食品理化检测》 （GB/T 27404-2008）对选择的检测方法应 分别对方法选择性、回收率、标准（校准） 曲线、精密度等技术要素进行确认，必要 时测定低限、准确度、稳定性、适用性 （耐用性）提取效率、不确定度（SD）等 要素进行确认。
选择性
• 对所选的方法，根据配方中各成分可能存在的干扰分别进行试验。在 功效成分(如总黄酮)来源于配方多种物质，应研究各物质对其指标的 贡献。选择性是衡量某一方法在实用中受其他因素影响程度大小的一 种量度。较高的选择性，是获得较高准确度的条件之。 • 用某种分析方法测定某组分时，能够避免样品中其他共存组分干扰的 能力。 选择性的表示通常在指定的测量准确度下，共存组分的允许量与 待测组分含量的比值。 • n=W（共存组分）/ W（待测组分），比值越大，表明在指定的准确 度下，该仪器方法的抗干扰能力越强，即选择性越好。提高分析方法 的选择性是分析化学中的一个研究内容。 • 可以通过不同的途径加以改善或提高。常取途径有二：①从仪器上改 进，例如，采用高效液相色谱法可以大大提高色谱分析的选择性。在 紫外-可见分光光度法中采用多阶导数处理，不仅可以使灵敏度得到提 高，更重要的是使方法选择性得到改善。②改进分析对应的条件，合 理选择反应的酸度、介质、反应离子的价态以及使用隐蔽剂等。
提取效率
• 提取效率可用以下方法进行试验: • a)用阳性的标准物质或水平测试的阳性样品 进行试验; • b)阳性样品用同一溶剂反复提取，观察被分 析物的浓度变化; • c)用不同提取技术或不同提取溶剂进行比较。
不确定度
• 测量不确定度是指“表征合理地赋予被测 量之值的分散性，与测量结果相联系的参 数”
• 4.5.14 检验检测机构应建立和保持检验检测方法控制程 序。检验检测方法包括标准方法、非标准方法（含自制 方法）。应优先使用标准方法，并确保使用标准的有效 版本。在使用标准方法前，应进行证实。在使用非标准 方法（含自制方法）前，应进行确认。检验检测机构应 跟踪方法的变化，并重新进行证实或确认。必要时检验 检测机构应制定作业指导书。如确需方法偏离，应有文 件规定，经技术判断和批准，并征得客户同意。当客户 建议的方法不适合或已过期时，应通知客户。 • 非标准方法（含自制方法）的使用，应事先征得客户同 意，并告知客户相关方法可能存在的风险。需要时，检 验检测机构应建立和保持开发自制方法控制程序，自制 方法应经确认。
稳定性
• 在测定的浓度下，设置不同的时间段进行 测定，经过实验证明样品稳定的时间。
耐用性
• 方法应具有对可变试验因素的抗干扰能力，当测定条件发生细 小变动时，方法应具有一定的保持测定结果不受影响的承受程 度。并给出平行两次测定的允差。 • 例如，分析中的样品性质、 • pH值、温度、所用试剂品种及使用量、人员等分析条件在适当 的范围内改变时，对测定值的稳定性进行的研究结果。其中， 试样性质是需要重点考虑的内容之一，任何一种方法都有其试 样适应范围，能否针对某种试样采用该分析方法需要经过严格 的验证，技术参数符合要求时方可采用，并形成相应的报告。 • 不同的色谱柱、试剂批号和牌号之间存在着一定的差别，这些 差别可能直接会影响到结果的准确与否，因此当改变上述内容 时均需要进行验证性实验并形成相应的报告。对于色谱柱还应 确定拖尾因子、分离度、容量因子、塔板数等指标。
• 1、检验检测机构应建立和保持检验检测方法控制 程序。检验检测机构应使用适合的方法（包括抽样 方法）进行检验检测，该方法应满足客户需求，也 应是检验检测机构获得资质认定许可的方法。查： 是否建立和保持使用适合的检验检测方法和方法确 认的程序； • 2、检验检测方法包括标准方法和非标准方法，非 标准方法包含自制方法。 • 3、当客户指定的方法是企业的方法时，则不能直 接作为资质认定许可的方法，只有经过检验检测机 构转换为其自身的方法并经确认后，方可申请检验 检测机构资质认定。
• 7、偏离指一定的允许范围、一定的数量和一定的 时间段等条件下的书面许可。检验检测机构应建立 允许偏离方法的文件规定。不应将非标准方法作为 方法偏离处理。查：方法偏离是否同时满足：有方 法偏离文件规定和经技术判定不影响结果、经批准 和客户同意四个条件，实施方法偏离时，是否保留 记录。 • 8、当客户建议的方法不适合或已过期时，应通知 客户。如果客户坚持使用不适合或已过期的方法时， 检验检测机构应在委托合同和结果报告中予以说明， 应在结果报告中明确该方法获得资质认定的情况。 查查：客户建议的检验检测方法不适当时，机构是 否通知客户，是否有必要的记录。
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检测限、定量下限测定低限（主成 分测定可不需要）
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把3倍空白值的标准偏差（测定次数n≥20）相对应的质量或浓度称为检出限。方法的测定低限按式（2）计 算: CL=3Sb/b （2） 式中: CL—方法的测定低限; Sb—空白值标准偏差(一般平行测定20次得到); b—方法校准曲线的斜率。 色谱法（GC、HPLC） 设：色谱仪最低响应值为S=3N（N为仪器噪音水平），则检出限按式（3）进行计算。检出限=最低响应值 /b = S/b （3） 式中： b——标准曲线回归方程中的斜率，响应值/μg 或响应值/ng；S——为仪器噪音的3倍，即仪器能辨认的最小 的物质信号。 7.5.2吸光法和荧光法 按国际理论与应用化学家联合（IUPAC）规定。 全试剂空白响应值按式（4）进行计算。XL =平均值+Ks （4） 式中： XL——全试剂空白响应值（除不加试样外，采用完全相同的分析步骤、试剂和用量（滴定法中标准滴定液的 用量除外），进行平行操作所得的结果。 平均值——测定n次空白溶液的平均值（n≥20）； s——n次空白值的标准偏差； K——根据一定置信度确定的系数。 对于已制定MRL的物质，方法测定低限加上样品在MRL处的标准偏差的三倍，不应超过MRL值。对于禁用物 质，方法测定低限应尽可能低。
比较
证实 对象
目的
确认 非标方法
是否使用
偏离 标准、非标
临时使用、非 常态 技术判定（一 定误差范围内、 一定的数量、 一定的时间段）
标准方法
是否有能力按照标准 方法展开检测校准工 作 从“人机料法环测” 去证明
方法
用五种方法来 确认或组合
源自文库
时限
使用一段时间
在转化为标准 方法前
偏离后仍需回 归常态
• 确认应是以下五种中的一种或组合，是成 本、风险和技术可行性的一种平衡（不确 定度、检出限、方法的选择性、线性、重 复性、稳健度、基体干扰等） • 1、使用参考标准或参考物质；2与其他方 法比较；3、实验室间比对；4、对影响结 果因素系统评价；5、不确定度的评定 • 保留确认和验证记录
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标准（工作）曲线
• 应描述校准曲线的数学方程以及校准曲线 的工作范围，浓度范围尽可能覆盖一个数 量级，至少作5个点(不包括空白)。相关系 数（r）不应低于0. 99，测试溶液中被测组 分浓度应在校准曲线的线性范围内。 • 回归方程的计算在绘制标准曲线时，可用 直线回归方程式计算，然后根据计算结果 绘制。用最小二乘法计算直线回归方程的 公式y=a+bX。
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4、检验检测机构在初次使用标准方法前，应证实能够正确地运用这些标准方 法。如果标准方法发生了变化，应重新予以证实，并提供相关证明材料。查： （1）检验检测报告是否使用检验检测标准的有效版本。（2）方法使用前是 否进行验证，保留方法验证记录，以证实检验检测机构能有效使用这些方法。 5、检验检测机构在使用非标准方法前应进行确认，以确保该方法适用于预期 的用途，并提供相关证明材料。查：非标准方法（含自制方法）使用前是否 经确认，方法变更后是否重新进行确认，保留确认和验证记录。如果方法发 生了变化，应重新予以确认，并提供相关证明材料。查方法变更后是否进行 验证，保留方法验证记录，以证实检验检测机构能有效使用这些方法。 6、如果标准、规范、方法不能被操作人员直接使用，或其内容不便于理解， 规定不够简明或缺少足够的信息，或方法中有可选择的步骤，会在方法运用 时造成因人而异，可能影响检验检测数据和结果正确性时，则应制定作业指 导书（含附加细则或补充文件）。 查：是否制定必要的作业指导书，查证作业指导书目录，审核其内容是否满 足要求。 查：核查检验检测细则（或作业指导书）是否满足要求。（必要时，细化标 准要求）
准确度
• 重复分析标准物质(实物标样)或水平测试样品，测 定含量(经回收率校正后)平均值与真值的偏差指导 范围见表3。 • 表3测定值与真值的偏差指导范围 • 真值含量/(mg/kg) 偏差范围/% • <0 .001 -50~+20 • 0 .001~0.01 -30~+10 • 0 .010~10 -20~+10 • l0~1000 <15 • 1000~10000 <10 • 10 000 <5
回收率
• 回收率是在没有标准物质情况下，测定的平均值与真值相符的程度。应在标 准值点、标准值点的上下20%，或标准曲线内的高中低进行三水平试验，或 在方法测定低限、两倍方法测定低限和十倍方法测定低限进行三水平试验;对 于已制定最高残留限量(MRL)的，回收率应在方法测定低限、MRL、选一合适 点进行三水平试验;对于未制定MRL的，回收率应在方法测定低限、常见限量 指标、选一合适点进行三水平试验。 用回收率表示方法，加入的标准物质的回收率按式（1）进行计算。 P= （x1-x2）/m （1） 式中：P——加入的标准物质的回收率；m——加入的标准物质的量；X1—— 加标试样的测定值；X2——未加标试样测定值。回收率的参考范围见表2。 表2回收率范围 被测组分含量/(mg/kg) 回收率范围/% >100 95-105 1-100 90-110 0. 1-1 80-110 <0. 1 60一120
精密度
• 同一样品的各测定值的符合程度为精密度。精密度试验值应在标准值点或 ±20%，或标准曲线内的高中低三水平试验值内。对于已制定MRL的，精密度 实验应在方法测定低限、MRL、选一适合点三个水平进行；对于未制定MRL的， 精密度实验应在方法测定低限、常见限量指标中选一适合点三个水平进行。 重复测定次数至少为6。实验室内部的变异系数参考范围见表3。 在某一实验室，使用同一操作方法，测定同一稳定样品时，允许变化的因素 有操作者、时间、试剂、仪器等，测定值之间的相对偏差即为该方法在实验 室内的精度。 表3实验室内变异系数(CV)/% 被测组分含量 CV% 被测组分含量 CV% 0. 1μg/kg 43 100 mg/kg 5. 3 1μg/kg 30 1 000 mg/kg 3. 8 10μg/kg 21 1% 2. 7 100μg/kg 15 10% 2. 0 1 mg/kg 11 100% 1. 3 10 mg/kg 7. 5
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9、检验检测机构应制定程序规范自己制定的检验检测方法的设计开 发、资源配置、人员、职责和权限、输入与输出等过程，自己制定的 方法必须经确认后使用。 • 查：非标准方法的使用，是否与客户达成协议。协议中是否包括能否 满足客户要求的说明。 • 查：非标准方法（含自制方法）的使用，事先征得客户同意，并告知 客户相关方法可能存在的风险等情况记录。 • 在方法制定过程中，需进行定期评审，以验证客户的需求能得到满足。 使用自制方法完成客户任务时，需事前征得客户同意，并告知客户可 能存在的风险。查：检验检测机构应建立和保持开发自制方法控制程 序（无参照方法情况）， • 查：是否有自定方法，是否是有计划及指定有资格经验的人员进行该 项工作（查人员要求）。 • 查：是否进行方法的可靠性确认和验证、规定方法的评价和使用等。 是否实施受控管理并保存记录。
检测方法的研究验证
• 参照《实验室质量控制规范 食品理化检测》 （GB/T 27404-2008）对选择的检测方法应 分别对方法选择性、回收率、标准（校准） 曲线、精密度等技术要素进行确认，必要 时测定低限、准确度、稳定性、适用性 （耐用性）提取效率、不确定度（SD）等 要素进行确认。
选择性
• 对所选的方法，根据配方中各成分可能存在的干扰分别进行试验。在 功效成分(如总黄酮)来源于配方多种物质，应研究各物质对其指标的 贡献。选择性是衡量某一方法在实用中受其他因素影响程度大小的一 种量度。较高的选择性，是获得较高准确度的条件之。 • 用某种分析方法测定某组分时，能够避免样品中其他共存组分干扰的 能力。 选择性的表示通常在指定的测量准确度下，共存组分的允许量与 待测组分含量的比值。 • n=W（共存组分）/ W（待测组分），比值越大，表明在指定的准确 度下，该仪器方法的抗干扰能力越强，即选择性越好。提高分析方法 的选择性是分析化学中的一个研究内容。 • 可以通过不同的途径加以改善或提高。常取途径有二：①从仪器上改 进，例如，采用高效液相色谱法可以大大提高色谱分析的选择性。在 紫外-可见分光光度法中采用多阶导数处理，不仅可以使灵敏度得到提 高，更重要的是使方法选择性得到改善。②改进分析对应的条件，合 理选择反应的酸度、介质、反应离子的价态以及使用隐蔽剂等。
提取效率
• 提取效率可用以下方法进行试验: • a)用阳性的标准物质或水平测试的阳性样品 进行试验; • b)阳性样品用同一溶剂反复提取，观察被分 析物的浓度变化; • c)用不同提取技术或不同提取溶剂进行比较。
不确定度
• 测量不确定度是指“表征合理地赋予被测 量之值的分散性，与测量结果相联系的参 数”