IncuCyte：长时间动态活细胞成像及数据分析系统.pdf

IncuCyte：非标记的、长时间动态活细胞成像分析仪

典奥生物

目前，大部分的细胞检测方法采用的仍然是传统的终点法——仅仅给出最终结果，而且往往需要标记细胞和破坏细胞。这种方法无法得到细胞在生长时的真正状态，也无法对细胞的生长过程做出动态的监测和分析。美国Essen公司开发了一款非标记的、长时间动态活细胞成像分析仪——IncuCyte，用一种非侵入式的方法，记录细胞的实时生长状态。

IncuCyte是一套用于长时间动态，非伤害式的活细胞成像分析平台。IncuCyte分为信号采集机和控制机两部分，信号采集机可放置于培养箱中，中间放置多种规格尺寸的板、皿、瓶及载玻片，在其下方有显微照相设备，通过显微拍照，对培养细胞进行连续的监测，并通过连接电脑和网络进行远程控制、数据读取与分析。系统可自动集中每个时间点的图像并自动生成动态录像（live video）。用户除了可以得到各种格式的图像或动态录像外，还可以得到由系统软件自动依据饱和度和计数分析生成的基于图像应用的图表，以显示细胞的变化及趋势。IncuCyte FLR可采集相差图像和荧光图像，可显示GFP，YFP和荧光素等；IncuCyte EX可以与自动化的平板和液体处理系统整合。它们都进行了光学组件的优化，成像清晰，无传统的光晕问题。

图１：培养箱中的IncuCyte

IncuCyte的优势：１）培养的细胞用相位差显微镜或荧光显微镜直接监测，为非破坏性的监测，细胞不用染色便可以观察监测，影像效果好；２）监测过程中细胞无需离开培养箱，不用担心培养条件的改变对细胞的影响；３）真正的长时间的动态活细胞成像，可达数天或数月，且没有传统显微系统的光晕问题，可以在384微孔板内监测细胞形态；４）图像处理软件自动依据饱和度和计数分析，量化细胞增殖；５）自动输出细胞生长曲线和细胞生长录像；６）通量大，可同时监测6块标准规格的细胞培养板/皿/瓶，细胞在384微孔板内实验，可以减少宝贵的药品消耗；７）支持超过200种的标准培养容器，无需特殊的培养容器，节约后期实验成本；８）可远程监控，进行数据读取和分析，无需反复出入细胞房，避免了潜在的污染隐患及人工出入观测之麻烦。

图２：IncuCyte内部结构，支持超过200种的标准培养容器

图３：IncuCyte记录的细胞的相差图像和增殖曲线

图３是IncuCyte记录的细胞增殖的相差图像和增殖曲线。左侧图像是在同一视野内间隔12小时拍摄的CHO细胞的相差图像，图像可以24小时连续生成，而无需将细胞移出培养箱。右侧的增殖曲线是依据间隔3小时的图像生成的，由软件自动将图像数据转换成定量的饱和度vs.时间的数据，生成动态的增殖曲线。最后图像会被导出成单独的JPEG文件或视频。

IncuCyte软件功能：通过联网的软件，用户可以在任何一台联网的计算机上操控仪器，而无需反复拿进拿出标本及出入细胞房，这使IncuCyte成为了一个“虚拟的培养箱”。用户可以在软件的操作界面上定义耗材的类型、拍摄的时间和位置。IncuCyte可以自动对焦，自动进行图像收集。对得到的图像也可以进行亮度、尺寸、对比度的显示控制。用户可以电子化标记器皿，并设定关键词，必要时可用设定的关键词搜索数据库，方便查询过去任何时间得到的图像和数据。用户还可以直接从软件中抓取图像、图表、曲线至Word、Excel、Powerpoint和Email中。生成的所有数据均可存档，并且数据和图表可以打包封存，便于用户带回家分析。

图４：软件操作界面

IncuCyte的应用：

1）监测细胞增殖（Proliferation）

可监测细胞形态上的变化，可用荧光标定细胞核，观察细胞核的大小及计数。

关键特性：1）由实时图像获得定量的动态的过程指标；2）指标为非侵入型，如单层饱和度；3）标记指标（GFP或活细胞染色）可进行细胞核计数；4）所有动态信号均

有图像和影片验证。

图5：不同细胞的生长曲线，每隔3小时拍照，自动生成单层饱和度VS.时间图表

2）细胞质控（Cell Culture QC）

监测细胞形态上的变化，对细胞培养进行质控，如进行自动化的细胞培养，用175T 培养瓶，培养出大量且高质量的细胞，可做进一步细胞分析实验的细胞来源。监测生长曲线与培养基的血清浓度的变化，寻找最适合的培养基的血清浓度。监测生长曲线与培养基的配方的变化，寻找最适合的培养基配方。

关键特性：1）获得增殖细胞的实时图像，无需标记和将细胞移出培养箱；2）用动态指标，如单层饱和度优化培养过程；3）对微孔板能进行极好的质控，专利的HD（高清晰度）成像模式能消除微孔板的弯液面缺陷（meniscus artifacts）；4）用object algorithms评价细胞生长，消除人为干扰；5）系统可观察大面积的细胞培养容器，增加了评估的准确性；6）所有指标都有图像和影片进行验证。

图6：不同血清浓度培养基中CHO-hERG细胞的增殖曲线，单层饱和度VS.时间图表，细胞在2％血清的培养基中的生长快于在10% 血清的培养基中的生长

3）监测细胞毒性（Cytotoxicity）

关键特性：1）动态读数：可以实时动态地记录细胞活性在不同生理环境下的短期和长期的变化，不需要事先决定一个广泛适用的终点；2）Mix and read：将YOYO-1直接加入全培养基的细胞中，移除了液体的吸气步骤（fluid aspiration steps），消除了受损细胞的细胞破裂（cell disruption）；3）自动数据获取：可在培养箱中自动收集相差图像和荧光图像；4）细胞形态区分：高对比度的相差图像和影像资料可以使用户定性地区别Cytotoxic和Cytostatic（抗增殖）的不同作用；5）高度可重复性：实时动态的细胞死亡记录是高度可重复的，Z’在0.6和0.8之间。

图7：不同浓度的Taxol对MDA-MB-231细胞的毒理实验，Taxol在24小时和48小时处加入，每隔3小时拍照，自动生成单层饱和度VS.时间图表

4）监测细胞凋亡（Apoptosis）

关键特性：1）可动态、持续地观察凋亡的发生；2）独特的“免洗”标记程序使定量更方便，避免在标记过程中洗掉死亡的或将死的细胞；3）与流式细胞仪不同，细胞无需移动，就可进行分析，同样的细胞可以被用于后续的动态的研究；4）从实时图像中可取得动态的过程指标，包括细胞凋亡目标计数或细胞凋亡的目标区域的标准化；5）相差图像可用来监测与凋亡相关的细胞形态上的改变；6）实验结束后用染料染色计量DNA总数目，可得到凋亡指数（apoptotic index），表示凋亡对象的百分比；7）可用于96孔微孔板的定量分析。

图8：细胞凋亡的荧光图像