第六章 2-DE 蛋白质样品制备、分离与图象分析

样品的复杂性
蛋白本身复杂性：
低丰度蛋白、极端蛋白（分子量、等电 点）、疏水性蛋白、修饰蛋白
样品来源
培养细胞样品，组织样品，体液样品 （血浆）－－－针对不同的样品处理的 方式亦不同
细胞样品

影响因素 培养条件 收获时间、培养基组成、刺激条 件等 收获细胞的洗涤 外来条件是否干扰 荧光标记、修饰、其它试剂处理 等等
瑞士生物信息研究所 WORLD-2DPAGE网子站 可连接30多种2D数据库。
思考题：
• 分步提取的原理与方法
• 简述从样品制备到数据库检 索的主要技术环节

A.蛋白质点检测
对每一个象素点构建一个算子operator.
根据光密度检测出完整蛋白质点。 手动执行:spot detection wizard 自动执行:initialise
B.背景消减 C.归一化处理 相对定量，便于不同胶的比较。 D.蛋白质点匹配 E.结果输出
IPG 3-10L
SDS-PAGE PLA-801-D、C株细胞蛋白通过在pH3-10L宽pH范围内进行二维电 泳所得的凝胶图谱。在pH3-10L和Mr14，000-97，400Da范围内利 用PDQUEST软件分析图象。（A）选取的是PLA-801-C株蛋白的扫 描图，（B）为经图象加工、背景消除的图象。PLA-801-D的图象 数据此处未示。
分析软件ImageMaster 2D Elite 3.10
ImageMaster 2D Database
Query with 2D Database
BEP2D细胞蛋白质2D-PAGE图谱差异点比较
Primary Passage 20 Passage 35
2-D蛋白斑点药物作用时间（h) 0
W
ImageMaster Version 3.0

Background removal using different methods.
ImageMaster Version 3.0
Getting Spot volume is as easy as clicking on a spot, the corresponding row is highlighted in the table. Clicking on a row, highlights and centers the spot in the image window. Histograms are available for each spot.
ImageScanner图像扫描系统
20 ´ 20 cm in 40 sec (at 300 dpi) Transmission and reflection mode 0.00 to >3.4 O.D. Scan color selection 14 bits / pixel (grey) Linked to ImageMaster
ImageMaster 凝胶图象分析流程图
Silver staining gel
Spot detect
Matching
Report
Normalization Differential map
ImageMaster Version 3.0

Spot Detection wizard

Accurate spot detection
94,000 67,000
43,000
Mw: 30Kd Mass: 2 ug
20,100
14,400
1-D Analysis
1-D Analysis
2、二维电泳蛋白质数据库
Appel等1996（Electrophoresis, 17: 540-546）提出网上联合数据库规范： （1）可远程关键词检索 （2）可与其他数据库连接 （3）可连接不同交叉参考数据库目录 （4）点击胶上蛋白点可调出单个蛋白 相关信息 （5）可进入联合电泳数据库
常用的图像分析软件

2-DE
ImageMaster 2D Elite PDQuest 7.0 Melanie 4.0 DeCyder

1-DE
ImageMaster 1D Elite ImageQuant
（1）2-DE胶图象采集
电感偶合装置（CCD） 光密度扫描 激光诱导荧光检测器等。 常用： ImageScanner GS-710 Typhoon
第六章
2-DE 蛋白质样品制备、 分离与图象分析
一、样品制备的重要性与基本要求
蛋白组研究最大难题： 据估计细胞内蛋白种类 100,000 低丰度蛋白 含义： 根据样品理化性质及生物学特性的不同， 进行优化处理， 使后续分析获得样本最大信 息量的方法。 取决于研究目的。
样品预处理达到的基本要求
从复杂到简单 一次实验中获得尽可能多的信息 良好的可重复性和可操作性
三、蛋白质分步提取技术 sequential extraction 基于蛋白质的溶解度不同，采用三种不 同提取液分步提取，分别电泳。 多间隔电泳法 multi-compartment-electrolyser
分步提取法： 低丰度蛋白质、膜蛋白（全细胞蛋 白）。
Molloy等（1998）， Electrophoresis,19:837-844. 建立： 分步提取法 + 高效裂解缓冲液方法。 第一步：水溶液提取 第百度文库步：Urea/CHAPS/DTT溶液 第三步：硫脲/SB3-10/TBP溶液
二、细胞裂解的方法 1、温和的裂解方法
适于组成简单的样品： 组培细胞、血细胞、微生物等。 （1）渗透裂解 用于血细胞、组培细胞。低渗溶液悬 浮细胞。 （2）冻融裂解 细菌、组培细胞。液氮快速冷冻，37 度融化，反复几次。
（3）去污剂裂解
去污剂溶解细胞膜、裂解细胞，用于 组织细胞。 （4）酶裂解法 消化细胞壁：植物、细菌、真菌。 纤维素酶、果胶酶、溶菌酶等。
2
6
12
24
T U
S
100
í Ê Ê Ê (%) ×± °° Ê
50
A C d D
0
0
6
12
± Ê Ê Ê ¨ hÊ Ê
18
24
A、C、d、D分别对应2-D电泳图上相应的蛋白质点
1-DE Image Analysis

蛋白质含量（纯度）信息 蛋白质pI/Mw分析
SDS-PAGE of SARS proteins
Typhoon

Multi-color
fluorescence

Phosphor-imaging Chemiluminescence
（2）2-DE胶图象分析
蛋白质点数统计、蛋白点定位、编号 和相对丰度分析等。
主要图象分析软件有： melanie II & 3, 4 PDQuest 7.0, ImageMaster 2D Elite 3.10 Phoretix 2D.
2、剧烈的蛋白裂解
用于难于破碎的细胞。 （1）超声裂解法 （2）弗氏压碎器（French Pressure cell） （3）研磨法 （4）机械匀浆法 （5）玻璃珠匀浆法
3、蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解
Protease inhibitor cocktail:
（1）PMSF: 灭活S, C蛋白酶. （2）AEBST：作用同上。 （3）EDTA, EGTA：抑制金属蛋白酶活性 （4）肽蛋白酶抑制剂：leupeptin, pepstatin A, aprotinin, bestatin. （5）TLCK, TPCK: S, C蛋白酶 （6）Benzamidine: S蛋白酶.
4、蛋白质沉淀 （1）硫酸铵沉淀（盐析） （2）TCA：10-20% （3）丙酮：3倍 （4）丙酮+TCA （5）苯酚提取，甲醇+醋酸铵 5、清楚杂质 （1）盐离子、带电小分子 （2）内源性小分子 （3）离子去污剂 （4）RNA, DNA
（5）多糖 （6）脂类 （7）酚类 （8）不溶物质 6、裂解液的组分 urera,1-几种去污剂。 CHAPS:兼性离子去污剂。 还原剂：DTT, DTE, TBP IPG buffer
4、存在问题 （1）低丰度蛋白检测 （2）极酸和极碱性区蛋白的分离 （3）高分子量区蛋白的分离 （>100kD） （4）膜蛋白分离 （5）高通量
六、图象分析与蛋白谱建立
1、图象分析系统 目的：
蛋白质表达谱（蛋白质点数目） 蛋白质分子量及等电点分析 蛋白质相对丰度及定量分析
蛋白质差异表达分析
器官
心脏、肝脏、脑、肌肉、脊髓
构成复杂－－－不同组织细胞组成
差别极大，细胞种类繁多
细胞构成
胞质溶胶 细胞核 线粒体 内质网 高尔基体 溶酶体 过氧化物酶体
蛋白复合体
样品制备原则： 1、方法简单，避免蛋白丢失 2、尽可能减少蛋白降解 3、新鲜制备，冷冻保存 4、超速离心 5、加尿素后加温不超过37度，防止氨 甲酰化而修饰蛋白。
四、亚细胞分离与蛋白质提取
低速离心
密度梯度
细胞核，未破碎细胞
细胞器（线粒体等）。
1、膜蛋白：低丰度、偏碱性、难溶。 2、核蛋白：强碱性蛋白（pI>10）
五、二维电泳
1、IEF （1）凝胶制备 （2）加样 （3）运行 （4）IPG胶条平衡 2、SDS-PAGE
3、胶上蛋白检测 （1）Commassie blue染色:30-100ng （2）银染:200pg （3）负染:<50ng, 铜染、锌-咪唑等。 （4）荧光染色： 丙基Cy3 + 甲基Cy5 SYPRO Ruby
2-DE Image Analysis:
Image documentation Spot detection Background subtraction pI/Mw calibration Spot normalization (归一化) Gel matching （匹配） Statistics analysis
举例
存在问题:
1.含大量血清白蛋白 2.培养条件不同导致 N蛋白的条带分离有变 3.SARS-CoV蛋白含量 低,鉴定结果重现性差
09-05-12
N蛋白
09-05-17
血清白蛋白
体液样品
高丰度蛋白：
白蛋白、 IgG
影响：对鉴
定造成干扰， 低丰度蛋白 的检出
去除前
去除后
组织样品
目前国际上蛋白质组研究的人组织