免疫印迹的化学发光底物原理

免疫印迹的化学发光底物原理

当底物发生化学反应而产生的能量以光的形式释放出来的时候，我们称这个过程为化学发光。鲁米诺（luminol）是最常用的化学发光试剂之一，被过氧化物氧化后它会产生一种激发态的产物——aminophthalate。这种产物衰变至低能态的同时释放出光子。专利添加物可以提高鲁米诺反应的发光强度和持续时间以及灵敏度。

化学发光底物被广泛使用是因为其具有其他检测方法不具备的优点，这些优点使得化学发光成为大多数蛋白实验室首选的检测方法。使用化学发光可以通过多次曝光获得最好的成像结果。还可以将检测试剂完全去除，再对其他目的蛋白进行检测并成像，或对检测条件进行优化。具有很宽的线性响应范围，从而可以检测并定量很宽浓度范围的蛋白质。最重要的是，化学发光在所有的检测方法中具有最高的灵敏度。使用辣根过氧化物酶标记的抗体和G-Biosciences公司的femtoLUCENT™ PLUS (货号 # 786-003)，可以检测的下限为飞克级，而这得益于这种底物

中的增强剂可以很大程度地增强发光强度并提高灵敏度。

化学发光底物与其他底物不同之处在于只有在酶和底物发生反应的时候才会产生瞬时

的可被检测的光。这与那些可产生稳定有颜色产物的底物不同；些有颜色的沉淀在酶-底物反应结束之后仍然存在于膜上。在化学发光免疫印迹中，底物是反应限制试剂。一旦其耗尽，光就会逐渐变弱并消失。实验中一定要使用适当稀释浓度的抗体，这样才会在几小时内产生稳定的光信号输出，从而维持蛋白检测的一致性和灵敏度。当抗体没被足够稀释时，永远不会获得稳定的光信号输出。系统中太多的酶会快速氧化底物并终止信号。

化学发光，鲁米诺在HRP和双氧水存在的条件下会被氧化形成激发态的产物（3-aminophthalate）。3-aminophthalate在衰变至基态的过程中会发出波长为425nm的光。

femtoLUCENT™ PLUS

化学发光的优点

灵敏性•强信号，低背景

•只需很少的抗原和抗体

快速•印迹上快速的底物处理

•信号在几秒钟之内产生

稳定•与放射性同位素不同，存放期很长

•4oC储存

硬拷贝结果•用X光胶片捕获结果

•结果不会随时间而褪色，不用担心膜的破裂

•永久保存

胶片结果•信号随曝光时间增强而增强

•可选择在不同时间曝光

•可优化显色的方法

印迹可重新检测•非同位素标记的探针可从膜上洗掉

•可重复进行免疫检测

宽线性范围•可检测很宽范围的蛋白浓度

可定量•可用反射型显象密度计或成像设备

（例如CCD相机）扫描X光胶片