现代分子生物学实验重点

现代分子生物学实验考试复习重点

一．判断题1.Maker(分子量标准)在DNA电泳中起荧光染料（对照）的作用。（错）2.用作DNA片段克隆的载体除质粒外，还有噬菌体和人工染色体等。（对）3.PCR扩增的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。（对）4.碱变性发提取质粒是根据碱性条件下染色体DNA不变性（变性）而质粒DNA变性（不变性）的原理。（错）5.基因工程中常用的限制性内切酶可对DNA进行特异性的识别和切割。（对）6.用于感受态细胞制备的大肠杆菌菌株一般为限制-修饰系统缺陷的变异株。操作中需要无菌、低温且动作要轻柔。（对）7.大肠杆菌转化过程中，细菌在LB液体培养基中进行恢复培养时，（不）应添加相应的抗生素。（错）8、转化中的蓝白颜色筛选，在LB固体培养基的平皿中添加IPTG 的作用是作为β-半乳糖苷酶作用的底物（诱导）。（错）X-Gal为生色底物。9.CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可破坏细胞膜，当低离子强度的溶液中CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，而不（可以）能沉淀核酸，因此将核酸与蛋白质等细胞内容物分开。（错）高离子强度的溶液不能沉淀核酸。10.一般可以用异丙醇和乙醇沉淀DNA和RNA。（对）

二．问答

1.PCR实验原理：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）简称PCR技术，是一种体外扩增特异DNA片段的技术。PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分为三步：1.变性：在高温条件下，DNA双链解离形成单链DNA；

2.退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；

3.延伸：

在DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达到~106~7个拷贝。

2.大肠杆菌感受态的制备（CaCl

法）⑴实验原理：用于感受态细胞制

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备的大肠杆菌菌株一般是限制-修饰系统缺陷的变异株。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。⑵注意事项：①感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响到其转化率，因此应尽量减少常温操作，动作要迅速。②为减少对细胞的机械损伤，操作时动作不能剧烈。③尽量在无菌状态下操作，减

少污染的可能。

3. 蓝白斑筛选原理：蓝白斑筛选是根据载体的遗传特征筛选重组

子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多质粒载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，β-半乳糖苷酶基因（lacZ）基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。

4. 碱性SDS法提取质粒实验原理：质粒是一种细菌染色体外的、具有

自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在碱性条件（pH 12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。

5. 已知一段基因序列，完成该基因的克隆。①提取该基因组中的

DNA，务必保证DNA的浓度和结构的完整性。②以目的基因为基础设计上下游引物，注意引物设计的原则，保证高度的特异性。③以基因组DNA为模板，取适量引物，模板，加入Taq酶，dNTP,Mg离子，buffer进行PCR反应，注意循环次数及退火温度的准确性等。④PCR 产物进行电泳分析，依据已知序列大小判断PCR结果是否正确之后进行目的DNA片段的凝胶回收。⑤回收的目的DNA与适当载体进行

DNA片段的连接，制备感受态细胞后，将连接的片段导入感受态细胞用蓝白斑筛选法进行重组子筛选，对筛选所得到的目的DNA扩大培养。⑥用碱法提取质粒，酶切，琼脂糖凝胶电泳分离DNA，扩大培养在提取质粒，送至测序公司测序。⑦测序结果与已知序列相

同，则该基因片段克隆完成。可保留阳性菌株扩大培养，提取质

粒，即可大量克隆该目的基因。

6. Trizol试剂快速提取植物总RNA实验原理：RNA是一类极易降解的

分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA

酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了

RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。Trizol方法得到的总RNA可以用来做

Northern,RT-PCR,分离mRNA,体外翻译和分子克隆等。

7. CTAB法提取植物基因组DNA实验原理：CTAB，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。本实验中利用CTAB破坏细胞膜，使DNA释放出来。在高盐溶液中CTAB与蛋白质和多醣形成复合物后，通过有机溶剂抽提去除蛋白质，多糖，酚类等杂质，最后加入异丙醇即可使DNA分离出来。

备用补充

实验一 聚合酶链式反应（PCR）技术

1 PCR技术的参数主要有7个：聚合酶、引物、dNTPs、反应buffer、二价离子、模板、一价离子。

2 ＤＮＡ模板：反应中ＤＮＡ量在５０ng～２００ng左右。且ＤＮＡ纯度较高， 以增加反应特异性。

3 dNTP:反应体系中达100μM～200μM。

4 Mg 2+：Mg 2+是Taq酶的辅基，浓度在2.0mM左右，浓度太低Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。

5 引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基左右；Ｇ＋Ｃ含量在40 ％－70％之间；引物内部不能有回文序列；引物３’端不能互补。

6 Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性ＤＮＡ聚合酶，在９５℃时３０分钟还有５０％活力。

7 变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性。

8 复性温度：５５℃左右，此温度选择是根据模板和引物配对结合强弱而定， 它是反应特异性的决定因素。

9 延伸温度：７０～７２℃左右，为Taq酶最适反应温度。

10 引物设计：（1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40 bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。

实验 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物（DNA）

一 实验原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系，可依据DNA分子的大小使其分