流式细胞仪的应用ppt_
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流式细胞仪的应用
主讲人：王银
流式细胞术在基础研究中的应用
➢ 细胞活力的检测 ➢ 细胞周期分析 ➢ 细胞凋亡分析 ➢ 多药耐药基因研究（MDR） ➢ RNA测定、DNA测定 ➢ 细胞内离子的测定及pH值测定
流式细胞术的临床应用
白血病免疫分型 HLA-B27: 强直性脊柱炎 淋巴细胞亚群 造血干细胞计数：造血干细胞移植 网织红细胞 PNH诊断（CD55、CD59） 血小板活化试验
√
Guava TUNEL
√
Guava MitoPotential 线粒体膜电位
√
细胞示踪
√
Guava CellToxicity 细胞毒性：NK，CMC，ADCC
√
Guava CellPaint 靶细胞监测
√
Guava CellGrowth 细胞增殖：原代细胞
√
细胞活力的检测
在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞， 总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。
√
Guava Express Cell Surface Antigen Detection 细胞表面蛋白检测
√
Guava RapidQuant 小鼠及人的IgG定量
√
细胞凋亡
√
Guava NexinAnnexin V结合
√
Guava Caspase 3/7
√
Guava Caspase 8
√
Guava MultiCaspase
在细胞凋亡过程中细胞形态学的变化
早早期凋亡的检测---capase3 早期凋亡Annexin-V-FITC/PI双染法 早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测 晚期凋亡---- “TUNEL”法 晚晚期凋亡-----DNA含量分析法
CV是变异系数。一般CV越小， 峰形越好，越尖锐。能控制在 5%左右是比较好的结果，一般 小 于 10% 就 可 以 认 可 了 。
应用DNA含量测定鉴定细胞凋亡
如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也 称sub-G0期)
• 在凋亡细胞中，用PI染色，通过流式检测DNA 含量，可以发现一种亚群的细胞，其染色荧光 强度下降。这是由于随着调亡的进行，核酸内 切酶活化，随后一部分DNA泄漏出去，造成细 胞内DNA含量下降造成的。
A typical DNA Histogram of cell proliferation
Hale Waihona Puke BaiduG0-G1
G2-M
S
# of Events
Fluorescence Intensity
样品制备
1000rpm 5分钟 收集2X106个细胞
PBS漂洗 70%酒精 两次 4度固定过夜
1000rpm 5分钟收集固定的细胞
结果解读
G0/G1期细胞占总的61.2%， 峰位于横座标的45.76
G2/M期占13.07，峰位于横座 标的91.43
S期占25.73 G2/G1为2.0（即G2期为4倍
体细胞，而G1期为2倍体细胞， 比值为2） 峰的变异系数为4.54%（好） 细胞碎片为0.48%，细胞聚集 体有0.06%。 总的细胞数（仪器检测到的） 为17525个， 在细胞周期中分析的细胞数为 17431个（即排除了碎片及聚 集体后）
细胞周期分析
➢ 在细胞周期内DNA含量各时期发生周期性变化，通过 荧光探针对细胞进行相对DNA含量测定，可分析细胞 周期各时期相对的百分比，了解细胞群体的倍体性和 增殖能力。 DNA含量常和某种细胞周期相关蛋白同 时检测，来分析细胞处于某一特定周期阶段。
➢ 恶变肿瘤细胞一般多出现异倍体，DNA含量分析对 肿瘤的诊断预后有很高的价值,尤其对细胞毒性药物 的研究很有价值。
流式细胞术在生殖医学中的应用
精子细胞和精子为单倍体细胞1C ; 次级精母细胞为二倍体细胞2C; 初级精母细胞和处于G2M期的精原细胞4C
细胞凋亡分析
细胞凋亡
特点：染色质的浓缩, 核膜及细胞膜的内陷, 接 着核碎裂成分离的片段,凋亡小体(apoptosis body)的出现。
在流式细胞仪上，对于光散射特性观察凋亡细胞 的改变：由于细胞的固缩，体积变小，FSC会变小， 而细胞碎片及颗粒增多，SSC也会改变。
M G2
G1
s
G0 G0G1
C o u n t
0
s G2M
200
400
600
800
1000
2N
4N
DNA content
G0 期细胞被认为是不参与增殖周期循环的一群细胞，即为静止细胞，其细胞 DNA 含量为较恒定的2N值，G1期细胞与G0期细胞DNA值相同，均为二倍体 DNA含量，当细胞进入S期后，DNA含量逐渐增加，当细胞DNA倍增结束，进 入G2期，最终进入M期，在M期分裂为两个子细胞之前，G2和M期细胞的DNA 含量均为恒定的4N值，即为四倍体细胞群。
离心
两次
PBS
漂洗
37度消化1小时
2.5μl 10μg/μl RNase A
0.5ml PBS
悬浮细胞
过300目细胞筛
50μl 0.1mg/ml PI （含1%Triton)
混匀，室温 静止5分钟
上机
经RNA酶处理前后的比较
RNA也是核酸，也会被PI染色，为避免干扰,染色前需用RNAse降解RNA。这 样PI只染DNA，能精确以荧光强度反映DNA的含量。
Dead Cell Discrimination
Cells should not be fixed/permeabilized prior to running on the flow cytometer. Cells are incubated on ice for 1 - 5 minutes in PI at a final concentration of 2ug/ml.
4 guava easyCyte™ 8HT 微毛细管细 胞分析仪
厂家：Millipore 获奖理由：突破性的微毛细管技术，无 需鞘液，样品体积少，废液更少，让细 胞分析变得更简单、快捷、易于操控
Guava 多种分析
Guava ViaCount 活细胞绝对计数
√
Guava Cell Cycle 细胞周期分析
# Events
Flow Cytometry of Apoptotic Cells
Apoptotic cells Normal G0/G1 cells
PI - Fluorescence
缺乏IL-3诱导的细胞凋亡
在DNA直方图上区分凋亡峰和细胞碎片峰
上图为细胞碎片峰，在二倍体G0/1峰之前呈左高右低的抛物线（蓝色） 上图为细胞凋亡峰，在二倍体G0/1峰之前呈对称分布的抛物线（蓝色）
主讲人：王银
流式细胞术在基础研究中的应用
➢ 细胞活力的检测 ➢ 细胞周期分析 ➢ 细胞凋亡分析 ➢ 多药耐药基因研究（MDR） ➢ RNA测定、DNA测定 ➢ 细胞内离子的测定及pH值测定
流式细胞术的临床应用
白血病免疫分型 HLA-B27: 强直性脊柱炎 淋巴细胞亚群 造血干细胞计数：造血干细胞移植 网织红细胞 PNH诊断（CD55、CD59） 血小板活化试验
√
Guava TUNEL
√
Guava MitoPotential 线粒体膜电位
√
细胞示踪
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Guava CellToxicity 细胞毒性：NK，CMC，ADCC
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Guava CellPaint 靶细胞监测
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Guava CellGrowth 细胞增殖：原代细胞
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细胞活力的检测
在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞， 总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。
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Guava Express Cell Surface Antigen Detection 细胞表面蛋白检测
√
Guava RapidQuant 小鼠及人的IgG定量
√
细胞凋亡
√
Guava NexinAnnexin V结合
√
Guava Caspase 3/7
√
Guava Caspase 8
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Guava MultiCaspase
在细胞凋亡过程中细胞形态学的变化
早早期凋亡的检测---capase3 早期凋亡Annexin-V-FITC/PI双染法 早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测 晚期凋亡---- “TUNEL”法 晚晚期凋亡-----DNA含量分析法
CV是变异系数。一般CV越小， 峰形越好，越尖锐。能控制在 5%左右是比较好的结果，一般 小 于 10% 就 可 以 认 可 了 。
应用DNA含量测定鉴定细胞凋亡
如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也 称sub-G0期)
• 在凋亡细胞中，用PI染色，通过流式检测DNA 含量，可以发现一种亚群的细胞，其染色荧光 强度下降。这是由于随着调亡的进行，核酸内 切酶活化，随后一部分DNA泄漏出去，造成细 胞内DNA含量下降造成的。
A typical DNA Histogram of cell proliferation
Hale Waihona Puke BaiduG0-G1
G2-M
S
# of Events
Fluorescence Intensity
样品制备
1000rpm 5分钟 收集2X106个细胞
PBS漂洗 70%酒精 两次 4度固定过夜
1000rpm 5分钟收集固定的细胞
结果解读
G0/G1期细胞占总的61.2%， 峰位于横座标的45.76
G2/M期占13.07，峰位于横座 标的91.43
S期占25.73 G2/G1为2.0（即G2期为4倍
体细胞，而G1期为2倍体细胞， 比值为2） 峰的变异系数为4.54%（好） 细胞碎片为0.48%，细胞聚集 体有0.06%。 总的细胞数（仪器检测到的） 为17525个， 在细胞周期中分析的细胞数为 17431个（即排除了碎片及聚 集体后）
细胞周期分析
➢ 在细胞周期内DNA含量各时期发生周期性变化，通过 荧光探针对细胞进行相对DNA含量测定，可分析细胞 周期各时期相对的百分比，了解细胞群体的倍体性和 增殖能力。 DNA含量常和某种细胞周期相关蛋白同 时检测，来分析细胞处于某一特定周期阶段。
➢ 恶变肿瘤细胞一般多出现异倍体，DNA含量分析对 肿瘤的诊断预后有很高的价值,尤其对细胞毒性药物 的研究很有价值。
流式细胞术在生殖医学中的应用
精子细胞和精子为单倍体细胞1C ; 次级精母细胞为二倍体细胞2C; 初级精母细胞和处于G2M期的精原细胞4C
细胞凋亡分析
细胞凋亡
特点：染色质的浓缩, 核膜及细胞膜的内陷, 接 着核碎裂成分离的片段,凋亡小体(apoptosis body)的出现。
在流式细胞仪上，对于光散射特性观察凋亡细胞 的改变：由于细胞的固缩，体积变小，FSC会变小， 而细胞碎片及颗粒增多，SSC也会改变。
M G2
G1
s
G0 G0G1
C o u n t
0
s G2M
200
400
600
800
1000
2N
4N
DNA content
G0 期细胞被认为是不参与增殖周期循环的一群细胞，即为静止细胞，其细胞 DNA 含量为较恒定的2N值，G1期细胞与G0期细胞DNA值相同，均为二倍体 DNA含量，当细胞进入S期后，DNA含量逐渐增加，当细胞DNA倍增结束，进 入G2期，最终进入M期，在M期分裂为两个子细胞之前，G2和M期细胞的DNA 含量均为恒定的4N值，即为四倍体细胞群。
离心
两次
PBS
漂洗
37度消化1小时
2.5μl 10μg/μl RNase A
0.5ml PBS
悬浮细胞
过300目细胞筛
50μl 0.1mg/ml PI （含1%Triton)
混匀，室温 静止5分钟
上机
经RNA酶处理前后的比较
RNA也是核酸，也会被PI染色，为避免干扰,染色前需用RNAse降解RNA。这 样PI只染DNA，能精确以荧光强度反映DNA的含量。
Dead Cell Discrimination
Cells should not be fixed/permeabilized prior to running on the flow cytometer. Cells are incubated on ice for 1 - 5 minutes in PI at a final concentration of 2ug/ml.
4 guava easyCyte™ 8HT 微毛细管细 胞分析仪
厂家：Millipore 获奖理由：突破性的微毛细管技术，无 需鞘液，样品体积少，废液更少，让细 胞分析变得更简单、快捷、易于操控
Guava 多种分析
Guava ViaCount 活细胞绝对计数
√
Guava Cell Cycle 细胞周期分析
# Events
Flow Cytometry of Apoptotic Cells
Apoptotic cells Normal G0/G1 cells
PI - Fluorescence
缺乏IL-3诱导的细胞凋亡
在DNA直方图上区分凋亡峰和细胞碎片峰
上图为细胞碎片峰，在二倍体G0/1峰之前呈左高右低的抛物线（蓝色） 上图为细胞凋亡峰，在二倍体G0/1峰之前呈对称分布的抛物线（蓝色）