高通量药物筛选利器——HTRF,原理介绍

HTRF 技术介绍

快速、稳定、不需洗涤、操作简单、易于自动化和微型化。上述优势使得Cisbio 的HTRF 技术一直是药物研发领域的领先技术之一，并广泛用于信号转导研究和免疫检测。该技术已经在知名医药公司、生物技术公司和学术研究机构应用了15年以上。

HTRF （均相时间分辨荧光，Homogeneous Time-Resolved Fluorescence ）是用来检测纯液相体系中待测物的一种常用方法。

该技术结合了荧光共振能量转移（FRET ，

Fluorescence Resonance Energy Transfer ）

和时间分辨荧光 （TRF, Time-Resolved

Fluorescence)）两种技术。这种结合将FRET

的均相实验方式和TRF 的低背景特点融合在一

起，使得HTRF 技术拥有如下优势：操作简单、

灵敏度高、通量大、实验数据稳定可靠、假阳

性率较低。HTRF 是基于TR-FRET 的化学技术，拥有与其它TR-FRET 技术相似的特征，包括使

用镧系元素（铕和铽），具有非常长的半衰期，很大的Stroke's shift （如图1所示，Eu 3+ Stroke’s shift > 300 nm ）等。除此之外，它还有其独特的性质，从而与其它技术区分开来。这主要表现在HTRF 的镧系元素与络合的穴相结合，而不是像其它所有TR-FRET 技术使用螯合物。螯合物在溶液中是一种动态平衡，在特定条件下不稳定；而HTRF 中应用的穴与镧系元素是永久地嵌合，非常稳定，可耐受较宽的pH 范围、二价金属离子如Mn 2+等、螯合剂如EDTA 等。HTRF 的独特之处还包括对数据的专利的比值处理方法，其能校正样品基质不同等带来的干扰。 FRET 技术简介

FRET 技术利用了两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为（能量）供体和（能量）受体，前者的发射光谱与后者的激发光谱重叠。供体被外来能源激发（例如闪光灯或激光），如果它与受体在足够近的距离之内，可以将能量共振转移到受体上。受体受到激发，发出特定波长的发射光。

将供体和受体分别与相互作用的两个生物分子结合，生物分子的结合可以将受体和供体拉到足够近的距离，产生能量转移。这时，我们可以检测到两个发射光，分别

为受体和供体的发射光。由于受体分子的发射光来自于能量转移，所以在

图1：铕穴状化合物的激发和发射光谱

实验中不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤。这种均相的实验方式操作简单，而且减少了实验时间和花费。如果与供体和受体结合的生物分子不存在相互作用，供体和受体距离较远，不能产生能量转移，则只能检测到来自于供体的发射光，如图2。

一般地，在FRET 实验中使用的供体和受体是快速荧光基团，半衰期非常短，背景荧光较强。背景荧光主要来自于荧光染料本身的干扰，以及样品成分的荧光和自发荧光，后者包括缓冲液、化合物和样品中的蛋白质、脂质、糖类等等的荧光信号。实验检测到的荧光信号必须对这些自发荧光进行校正，极大地影响了实验灵敏度，并使数据分析变得复杂。

HTRF 技术使用镧系元素作为供体，其属于长寿命荧光，可通过时间延迟的检测方式将背景荧光去除，提高了灵敏度，并使数据真实可靠。

TRF 技术简介

如前所述，样品中的很多成分具有较强的荧光和自发荧光，利用传统的快速荧光基团进行检测极大地限制了实验灵敏度，并且不能反映样品的真实情况。使用长寿命的荧光基团结合时间延迟的检测方式（在荧光激发和发射检测之间有一个时间延迟）可将快速荧光的干扰降到最低。

图2：FRET 技术的原理

时间延迟的检测方式，是通过时间分辨荧

光（TRF ）技术实现的，其利用稀土元素中

镧系元素的独特性质。在TRF 中常用的镧

系元素是钐（Sm ）、铕（Eu ）、铽（Tb ）和

镝（Dy ）。与传统荧光基团相比，它们具有

大的Stoke's shifts 和非常长的发射半衰期（从微秒到毫秒）。镧系元素的Stoke's

shifts 通常为300 nm ，检测的发射光中没

有来自于激发波长的干扰。HTRF 技术中镧系元素的半衰期大于1毫秒，与普通荧光纳

秒级的半衰期相差6个数量级。当延迟50微秒读数时，普通荧光的信号近似于零，镧系元素的信号改变很小。所以，HTRF 技术的数据真实可靠，假阳性低。

为了能够成功应用于生物学检测中，稀土元素复合物应该具有特定的性质，包括较强的稳定性、较高的发射光产率，并且能够与生物分子连接。除此之外，当直接在生物溶液中检测时，能够耐受荧光淬灭就显得尤为重要。稀土元素螯合物在特定条件下稳定性较差，并且有的化合物与螯合物活性基团发生反应，产生竞争，增加了其不稳定因素。HTRF 技术应用穴状化合物，整个体系非常稳定，没有光漂白现象，可在至少48小时内反复多次检测。

HTRF 技术的能量供体（Donor ）和能量受体（Acceptor ）

HTRF 的供体是铕穴状化合物（Eu 3+ cryptate ）或Lumi4™铽穴状化合物（Tb 2+ cryptate ），后者是近年与Lumiphore 公司合作的结果，激发效率更高。两者的能量受体（Acceptor ）均可为XL665和d2。XL665和d2激发波长为620 nm ，发射波长为665 nm ，位于近红外光区，进一步降低了样品本身对实验的影响（生物学样品很少在近红外光区有自发荧光）。对于铽穴状化合物来说，其受体也可以是Fluorescin 、GFP 等发绿色荧光的分子，所以可以进行双标记测量。XL665是改良过的别藻蓝蛋白（APC ），其将APC 的亚基偶联，使其不能解离，增加了稳定性。d2是第二代受体，光谱学特征与XL665相同，但是分子量较小，约为1KD ，可减少空间位阻对实验的可能影响。

当由于生物分子相互作用导致两个荧光基团接近时，在激发时被穴状化合物捕获的能量部分释放，发射波长为620 nm ；另一部分能量共振转移到XL665或d2，使其发光，发射波长为665 nm 。665 nm 的发射光仅仅由穴状化合物作为能量供体的FRET 产生。所以，当生物分子相互作用时，有两个激发光620 nm 和665 nm ；

图3：TRF 技术的原理 图3：TRF 技术的原理