双向电泳--标准操作(完整版)

细胞裂解（蛋白质提取）

一、试剂配置：

PBS配方

氯化钠(MW 58.44) 130mM 8g

氯化钾(MW 74.5) 2.7mM 0.2g

十二水和磷酸氢二钠(MW 358) 10 mM3.63g

磷酸二氢钾(MW 136) 2 mM0.24g

加水至1L配好后进行高压灭菌。

Washing buffer（500mL）配方

Tris（MW 121.1） 10mM 0.605g

蔗糖（MW 342） 250mM 42.75g

加水溶解，用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22µm滤膜过滤（使用1M盐酸略高于2750uL调pH）

裂解储液配方（细胞）：

尿素(MW 60.06) 7M 4.2g

硫脲(MW 76.12) 2M 1.52g

CHAPS(MW614.89) 4%（W/V）0.4g 加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。

裂解储液配方（组织）：

尿素(MW 60.06)5M3g

硫脲(MW 76.12) 2M1.52g

CHAPS(MW614.89) 2% 0.2g

Tris（MW 121.1）40mM 0.048g

加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。

裂解液：

裂解液储液 100uL

IPG buffer（pH可选） 2% 2uL

Pi 2uL

NucLease mix（100×） 1uL

PMSF（100mM：20mg/mL） 1mM 1uL

DTT（0.411g/mL） 40mM 1.5uL

Pi：每片使用200uL超纯水溶解后按10 uL分装

考马斯亮蓝G-250：

考马斯亮蓝G-250 0.01% 100g

95%乙醇 4.7% 50ml

H3PO4 8.5% 85g 将考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇中，与用水溶解的100ml H3PO4混合后稀释至1000ml，之后使用滤纸过滤。

二、实验准备：

1、准备冰盒，细胞裂解过程均在冰盒内进行（4℃）；

2、准备4℃离心机，开机降温，保证温度下降至4℃；

3、取出置于-20℃保存的试剂，需冰上融化，最后取出细胞样品。

三、样品制备：

（一）细胞

细胞裂解准备：

1、收集细胞，使用大于500g转速离心5min；

2、弃去上清，使用washing buffer重悬细胞沉淀，震摇待

细胞完全打散后，继续用大于500g转速离心5min；

3、重复步骤2两次，并使用转速2000rpm离心5min，弃上清。

细胞可置于-80冰箱保存数周，或使用裂解液裂解。

细胞裂解：

1、配置裂解液：注意先不要加入DTT。临用前加入PMSF后，

立即将细胞裂解液加入待裂解的细胞中。

2、加入裂解液的细胞置于冰盒内，每隔5-7min取出，于漩

涡振荡器上震摇数秒，并再次放于冰盒中，保证细胞裂解

时的温度为4℃。

3、裂解15-20min后加入DTT。

4、裂解完成后，置于4℃离心机中，以最大转速13200rpm离

心30min，取上清，弃沉淀。上清所含提取的蛋白。

5、使用bradford法测定提取蛋白浓度。

（二）、组织：

组织裂解准备：

1、提取动物组织。提取时务必保证组织的纯度，尽量减少组织

混杂，尤其注意血液的混入。

2、使用washing buffer冲洗组织2-3遍，洗净组织的血液、体

液、和其他影响实验结果的残留成分。

3、准备研钵，洗净并且烘干，准备适量的组织裂解液，准备充

足的液氮，石英砂适量。

组织裂解：

1、配置裂解液：注意先不要加入DTT、 PMSF。

2、将适量石英砂加入到研钵中，加入液氮冷却。

3、将组织放入装有液氮的研钵中，研磨组织，在研磨过程中保

证样品在低温状态下。

4、研磨完成后将样品及石英砂收集到离心管中，在裂解液中迅

速加入PMSF，混匀后将裂解液加入含有样品的离心管中。保持4℃，震荡混匀，每隔5-7min取出，于漩涡振荡器上震摇数秒，并再次放于冰盒中。

5、裂解15-20min后加入DTT。

6、使用2000g离心10min，吸取上清即为所提取的蛋白，下层

石英砂及组织碎片则丢弃。将上清使用13200g转速离心，弃去沉淀。

（三）、血清：

血清样品可直接用于双向电泳实验。

但样品中含有大量的IgG和白蛋白，需要使用试剂盒去除。四、试剂说明：

裂解液成分：

溶液中还原剂的含量不要超过20mM。

尿素/硫脲：变性剂，中性促溶剂，促进样品溶解，破坏氢键等次级结构，使所有离子基团暴露在溶液里。硫脲可以促进膜蛋白的溶解。尿素在30℃以上容易降解，降解产物异氰酸盐可使样本中蛋白质甲氨酰化，对蛋白质进行修饰，造成等电点改变，形成人为地“斑点串”。

CHAPS:两性表面活性剂，CHAPS是一种非变性的zwitterionic 去垢剂、蛋白质裂解液，用于增溶膜蛋白和裂解蛋白-蛋白之间的相互作用。CHAPS是两性离子去垢剂，分子结构中具有一个胆酸和硫代甜菜碱。在紫外区的低吸光性成为用紫外方法检测膜蛋白的首选去垢剂，CMC值均为8 mM。常用于于双向电泳等实验。原理：CHAPS保护蛋白质的天然状态，可溶解膜蛋白，从而互作用。透析可除去。

SDS：(FW 288.38)离子型去垢剂，裂解力强，基本可以把细胞完全破坏掉。并且使蛋白变性失活。不得与强氧化剂混合。它也可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸蛋白复合物。NP-40：乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P40；）很温和的非离子型去垢剂，1%浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱，结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。与蛋白结合力强，用于防止物质分子疏水间相互作用，确保蛋白的充分溶解和结构稳定。尤其用于膜蛋白的非变性条件下的溶解。