附双向电泳完整的操作步骤第一向等电聚焦1从冰箱中取-20
双向电泳详细操作过程
蛋白质的双向电泳一、实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE 是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。
这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
二、实验步骤：1. 芽孢杆菌蛋白质的提取2. 蛋白质样品的纯化将经过硫酸铵沉淀的蛋白质冷冻干燥，放在-80度冰箱里备用，取出蛋白质干粉300mg 加水化液(尿素水化储备溶液)400ul，加丙酮酸（加DTT）1.6ml，放置-20度冰箱2h，离心，吸除丙酮酸，用超纯水中（加DTT），清洗两次，离心，加水化液溶解。
水化液配置：用dd H20定容水化液浓度100ml 20ml尿素（60.06）7M/L 42.0g 8.4g硫脲（76.12）2M/L 15.2g 3.04gCHAPS 4% 4g 0.8gDTT(154.2) 1% 1g 0.2g（注：DTT现用现加）3. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。
取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 20ul, 40ul, 60ul, 80ul , 100ul的BSA溶解液，在分别加入100ul,80ul,60ul ,40ul,20ul,0ul, 分别加入4ml的Bradfor。
另取2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，各管中分别加入4ml的Bradfor，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。
(测量过程要在一个小时内完成)。
例如：标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为OD值，X为蛋白含量。
a、b通过作图输入数据可知G250的配置：称取G250 固体0.1g加水定容至1L。
使用前滤纸过滤。
比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。
简述双向电泳技术分离蛋白质的基本技术流程
简述双向电泳技术分离蛋白质的基本技术流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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双向电泳操作步骤
双向电泳操作步骤双向电泳操作步骤及相关溶液配置A(实验过程一实验原理:2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。
这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
二实验步骤:1. 样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。
其中每隔10,15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，—80oC保存。
2. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。
取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 5ul,10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水(总体积为80ul)，然后，各管中分别加入4ml的Bradford液(原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用)，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。
(测量过程要在一个小时内完成)。
3. 双向电泳第一向---IEF(双向电泳中一律使用超纯水)3.1 水化液的制备称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05, 的溴酚兰，3.5ul(0.5,v/v)IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。
在含300ug 蛋白(经验值)的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清。
3.2 点样，上胶分两次吸取样品，每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开 Immobiline DryStrip gels (18cm，pH 3—10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。
双向电泳实验操作流程
双向电泳实验操作流程机器型号：GE第一向：等电聚焦（IEF）1．对样品的要求：IEF能否成功主要取决于样品状态和离子强度，一般蛋白制备采用Trin-HCl 为缓冲液，加等渗蔗糖。
根据染色方法和胶条的长度决定上样量，一般是20μg/mL -1mg/mL。
考马斯亮蓝染色较银染需要较大的上样量。
2．IEF准备注意事项：DTT和IPG现用现配，由于DTT是还原剂，长时间放置易氧化，所以可以选择干物质使用。
DTT的作用是和尿素配合打散蛋白质结构，CHAPS为碱性去垢剂，和SDS作用相似，溶解尿素时温度不可超过37℃，因为超过37℃蛋白质会发生氨甲酰化，尽量在生产日期一年内使用。
清洗IEF胶条槽时用专用清洗剂，原液清洗或2%浓度浸泡清洗。
3．上样：胶条使用前20min从冰箱（4℃）中取出。
上样可以采用水化上样或者使用上样杯（先水化，后上样），上样杯上样适用于极性等电点蛋白质，水化12h后，在电泳槽上样。
以水化上样为例：先将250μL样品和水化液（需要当天配制）混合物加到胶条槽里，然后从尖端（阳性端）撕掉保护膜（带IO号），将胶条支持膜向上，胶面向下，用配用镊子夹住平端放入胶条槽中，注意不要产生气泡，用覆盖油覆盖，盖上盖子。
说明：放入胶条槽中的胶条上的字应该顺向能够读出，说明胶条放的对，如果读不出来，说明放反了。
在电脑软件中设置操作参数：水化上样分为被动上样（就是这种浸泡状态维持约16h）和主动上样（加电压30V，大约需要10h）。
上样后即可进行IEF电泳。
注意每种胶条最大的电流不能超过50μA。
一般是30V电压水化12h，然后200V、500V、1000V各1h，最后用8000V电压电泳至结束。
4.胶条的平衡：平衡液制备时先将SDS在加热的条件下溶解于水中，SDS溶解后冷却至20℃左右，在加入尿素充分溶解，然后加甘油混匀成水溶液。
将该水溶液分成两份，每份15mL，分装到两个平衡管中，其中一个管中加DTT，另一个管中加IAA，DTT可以打开蛋白的二硫键，防止在聚焦时形成的氧化导致在第二向拖尾，尿素、甘油可以降低电离效应，使胶条可以很好的转入第二向，IAA可以将去除DTT。
双向电泳操作流程
双向电泳完整操作流程仪器：Eppendorf 冷冻离心机 (Eppendorf)、Beckman Coulter 高速冷冻离心机（Beckman Coulter）、IPGhor 等电聚焦仪（GE Healthcare）、DALT-SIX SDS-PAGE电泳仪（GE Healthcare）、ImageScanner扫描仪（GE Healthcare）、ImageMaster 2D Platinum 7.0分析软件（GE Healthcare）、电子天平、分光光度计、旋涡混和器、PH计、真空冷冻干燥机、液氮、离心管、研钵主要溶液配置：三氯乙酸-丙酮沉淀液：10%三氯乙酸、0.07%巯基乙醇溶于100%丙酮丙酮洗涤液：0.07%巯基乙醇溶于丙酮样品裂解液：9mol/L尿素、4％CHAPS、1%IPG buffer（GE Healthcare）、1%DTT样品水化液：9mol/L尿素、4％CHAPS、1%IPG buffer（GE Healthcare）、1%DTT、少量溴芬兰定量染色液：0.01%（w/v）G250，8.5%磷酸和4.75%乙醇标准蛋白溶液：1mg/ml牛血清蛋白平衡缓冲液1：6mol/L尿素、50mmol/L Tris-HCL(pH=8.8)、30%甘油、2%SDS，1%DTT，痕量溴酚兰平衡缓冲液2：6mol/L尿素、50mmol/L Tris-HCL(pH=8.8)、30%甘油、2%SDS，4%碘乙酰胺，痕量溴酚兰12%SDS-PAGE凝胶溶液：12%丙烯酰胺、0.32%双丙烯酰胺、0.375mol/L Tris-HCL（pH=8.8）、0.1%SDS、0.05%过硫酸铵、0.05%TEMED 电泳缓冲液：25mmol/L Tris、192mmol/L甘氨酸、0.1%SDS封胶液：25mmol/L Tris、192mmol/L甘氨酸、0.1%SDS、0.5%琼脂糖考染固定液：12%（W/V）三氯醋酸考染染色液：0.12%G-250、10%（NH4）2SO4、10% H3PO4、20%甲醇。
双向电泳使用说明
第一部分介绍1.0手册的介绍这本手册分五大部分。
第一部分对手册进行了介绍。
第二部分介绍了样品预处理的方法。
第三部分细叙了进行双向电泳第一向电泳的过程。
第四部分介绍了利用IPG胶条进行第二向电泳的一般方法。
第五部分讨论了双向电泳的显影和结果分析。
在这里，使用Amersham pharmacia Bioteeh公司的产品进行双向电泳介绍，设备的选择我们在1、2节中介绍。
1.1 双向电泳的介绍双向电泳是分析从细胞、组织或其它生物样品中提取出来的蛋白混合物最有力和广泛运用的方法。
这项技术利用蛋白质在两次独立的分离步骤中的特性将蛋白质分开：第一向步骤——等电聚焦（IEF）根据蛋白质的等电点（PI）将蛋白质分离。
在第二向步骤中SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）利用蛋白质的分子量（MW）大小将它们分离。
二向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。
因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。
双向电泳在1975年由P.H.OFarrel[1]和J.Klose[2]提出，在早先的技术中，第一向分离在含有载体两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶载体中进行，这种胶在狭窄的试管中灌注而成。
样品放入管胶的某一端，并且在很高的电压下将它们分开。
在完成等电聚焦（IEF）以后，凝胶棒从管子中取出来，在SDS样品缓冲液中平衡。
随后，放在垂直SDS—聚丙烯酰胺凝胶上，进行第二向分离。
自从双向电泳被被提出以来，双向电泳作为生化分离技术的重要性事实上早已被承认。
但是，它是在最近几年被广泛应用的，由于在各方面的改进。
■2—D技术被改进而产生了2—D的图象，这在分辨率和重复性上有很大提高。
这项新技术是由A.Gorg和他的同事发明的。
在2—D技术中，使第一向电泳得到了改进，利用固定的pH梯度代替了载体两性电解质产生的pH梯度，并且用塑料胶片支撑的凝胶条代替了柱状凝胶。
在章节3.1“Background to IEF”中阐述了这种技术的优越性。
双向电泳--标准操作(完整版)
细胞裂解（蛋白质提取）一、试剂配置：PBS配方氯化钠(MW 58.44) 130mM 8g氯化钾(MW 74.5) 2.7mM 0.2g十二水和磷酸氢二钠(MW 358) 10 mM3.63g磷酸二氢钾(MW 136) 2 mM0.24g加水至1L配好后进行高压灭菌。
Washing buffer（500mL）配方Tris（MW 121.1） 10mM 0.605g蔗糖（MW 342） 250mM 42.75g加水溶解，用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22µm滤膜过滤（使用1M盐酸略高于2750uL调pH）裂解储液配方（细胞）：尿素(MW 60.06) 7M 4.2g硫脲(MW 76.12) 2M 1.52gCHAPS(MW614.89) 4%（W/V）0.4g 加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。
裂解储液配方（组织）：尿素(MW 60.06)5M3g硫脲(MW 76.12) 2M1.52gCHAPS(MW614.89) 2% 0.2gTris（MW 121.1）40mM 0.048g加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。
裂解液：裂解液储液 100uLIPG buffer（pH可选） 2% 2uLPi 2uLNucLease mix（100×） 1uLPMSF（100mM：20mg/mL） 1mM 1uLDTT（0.411g/mL） 40mM 1.5uLPi：每片使用200uL超纯水溶解后按10 uL分装考马斯亮蓝G-250：考马斯亮蓝G-250 0.01% 100g95%乙醇 4.7% 50mlH3PO4 8.5% 85g 将考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇中，与用水溶解的100ml H3PO4混合后稀释至1000ml，之后使用滤纸过滤。
双向电泳法
双向电泳法双向电泳法（Bidimensional Electrophoresis，2-DE）是一种常用的蛋白质分离技术，可以同时分析样品中上千种蛋白质。
本文将详细介绍双向电泳法的原理、步骤和应用。
原理双向电泳法结合了等电聚焦（IEF）和SDS-PAGE两种技术，通过两个维度的分离将复杂的蛋白质混合物分解为一系列单独的斑点。
在第一维度中，根据蛋白质的等电点（pI）进行分离；在第二维度中，根据蛋白质的分子量进行分离。
通过将这两个维度的分离结果叠加，可以获得高分辨率的蛋白质图谱。
双向电泳法的关键步骤如下：1.等电聚焦（IEF）：在第一维度中，使用等电聚焦技术将样品中的蛋白质按照其等电点进行分离。
等电聚焦是一种基于蛋白质在电场中向氧化物离子（OH-）或氢离子（H+）方向移动的分离方法。
在等电聚焦过程中，蛋白质会在pH梯度中向其等电点迁移，直到净电荷为零。
通过控制pH梯度和应用的电压，可以将蛋白质在等电聚焦过程中分离开。
2.SDS-PAGE分离：在第二维度中，将第一维度的等电聚焦凝胶与SDS-PAGE凝胶垂直叠加。
在SDS-PAGE凝胶中，蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶的孔隙随着电场的作用向阳极迁移。
由于SDS（十二烷基硫酸钠）的存在，蛋白质在SDS-PAGE凝胶中的迁移速度与其分子量成反比。
因此，蛋白质在SDS-PAGE 凝胶中会根据其分子量进行分离。
3.染色和分析：经过双向电泳分离后，凝胶可以通过染色方法显示出一系列斑点，每个斑点代表一个蛋白质。
常用的染色方法包括银染法、荧光染色、贵金属染色等。
对于银染法，它在灵敏度和线性范围上具有优势。
染色后可以使用成像设备捕捉图像并进行定量分析。
通过对斑点的比较和定量，可以识别不同样品之间的差异和变化。
步骤双向电泳法的步骤如下：1.样品制备：将待分析的生物样品（如细胞提取物）进行蛋白质提取，并使得蛋白质在石蜡中可溶解。
常用的方法包括总蛋白提取、亲和层析、激光捕获等。
2.等电聚焦（IEF）：将蛋白质样品与具有连续pH梯度的凝胶进行接触。
Bio-rad 双向电泳系统标准操作规程
Bio-rad 双向电泳系统标准操作规程1、目的：正确使用Bio-rad 双向电泳系统，确保Bio-rad 双向电泳系统正常运行。
2、适用范围：Bio-rad 7cm/11cm/17cm双向电泳系统。
3、责任人：双向电泳系统操作人员。
4、程序：4.1、第一向等电聚焦4.1.1、准备工作及注意事项用标配的刷子小心将聚焦盘清洗干净，注意聚焦盘两端的两根电极丝，晾干后备用；根据样品使用合适的水化上样液，对于不同的聚焦盘的上样体积可参考下表：4.1.2、上样4.1.2.1、从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管，置室温溶解，加入合适的DTT与Bio-Lyte，充分混匀。
4.1.2.2、从小管中取出适量水化上样缓冲液与样品充分混匀。
4.1.2.3、取出-20℃冷冻保存的IPG预制胶条，室温中放置10分钟。
4.1.2.4、沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。
在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。
注意：不要产生气泡。
否则影响到胶条中蛋白质的分布。
4.1.2.5、当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。
4.1.2.6、分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。
确保胶条与电极紧密接触。
不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。
同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。
如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。
4.1.2.7、在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。
需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
4.1.2.8、对好正、负极，盖上盖子。
设置等电聚焦程序。
4.1.3、设置程序4.1.3.1、打开电源；4.1.3.2、根据情况选择水化（REHYDRATION），预设的程序（PRESET METHOD），储存的程序（STORED METHOD），新的程序（NEW METHOD）；4.1.3.3、如果只需要水化，选择水化（REHYDRATION）选项，在接下来的界面选择主动水化或者被动水化、水化温度、水化时间；4.1.3.4、如果需要跑完整的程序，选择新的程序（NEW METHOD）, 在接下来的界面选择是否水化，并设置相应的等电聚焦程序，设置完成后，在最后的界面选择总的胶条数、限电流和聚焦温度，然后开始运行程序。
BIO-RAD双向电泳中文手册
ProteomicsBio-Rad蛋白质组双向电泳实验操作手册 ProteomeWorks TM System双向电泳实验流程z样品制备（Sample preparation）z固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration）z第一向等电聚焦（IEF）z胶条的平衡（IPG strip equilibration）z第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGE electrophresis） z凝胶的染色及检测（Detection/Staining）z PDQuest软件分析（Software analysis）z质谱鉴定（Protein identification）目 录第一章 实验材料1．1 IPG预制胶条及载体两性电解质1．2 蛋白质定量试剂盒及其试剂1．3 试剂盒及其试剂1．4 化学试剂1．5 蛋白质Marker1．6 染色试剂1．7 注意事项第二章 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 2. 1 溶液的配制2. 2 SDS-PAGE凝胶的配制2. 3 操作方法2. 4 注意事项第三章 双向电泳3. 1 溶液配制3. 2 操作步骤3. 3 注意事项附录1 双向电泳完整的操作步骤附录2 聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配置 附录3 细胞样品的一般处理步骤附录4 组织样品的一般处理步骤第一章 实验材料1．1 IPG预制胶条及载体两性电解质（一）IPG预制胶条（美国Bio-Rad公司），-20℃冰箱保存cm 163-2000 IPG预制胶条 pH 3-10，7，nonlinear（NL） 163-2002cmIPG预制胶条 pH 3-10， 7cm 163-2001 IPG预制胶条 pH 4-7，7cm 163-2003 IPG预制胶条 pH 3-6，7cm 163-2004 IPG预制胶条 pH 5-8，7cm 163-2005 IPG预制胶条 pH 7-10，7IPG预制胶条 pH 3-10，17cm 163-2007cm，nonlinear（NL） 163-2009 IPG预制胶条 pH 3-10， 17IPG预制胶条 pH 4-7，17cm 163-2008 IPG预制胶条 pH 3-6，17cm 163-2010 IPG预制胶条 pH 5-8，17cm 163-2011 IPG预制胶条 pH 7-10，17cm 163-2012 IPG预制胶条 pH 3-10，18cm 163-2032 IPG预制胶条 pH 3-10， 18cm，nonlinear（NL） 163-2033 IPG预制胶条 pH 4-7，18cm 163-2034 IPG预制胶条 pH 3-6，18cm 163-2035 IPG预制胶条 pH 5-8，18cm 163-2036 IPG预制胶条 pH 7-10，18cm 163-2037 IPG预制胶条 pH 3-10，11cm 163-2014 IPG预制胶条 pH 3-10， 11cm，nonlinear（NL） 163-2016 IPG预制胶条 pH 4-7，11cm 163-2015 IPG预制胶条 pH 3-6，11cm 163-2017 IPG预制胶条 pH 5-8，11cm 163-2018 IPG预制胶条 pH 7-10，11cm 163-2019 IPG预制胶条 pH 3.9-5.1，17cm163-2020163-2021 IPG预制胶条 pH 4.7-5.9，17cmIPG预制胶条 pH 5.5-6.7，17cm163-2022163-2023 IPG预制胶条 pH 6.3-8.3，17cm163-2038 IPG预制胶条 pH 3.9-5.1，18cm163-2039 IPG预制胶条 pH 4.7-5.9，18cm163-2040 IPG预制胶条 pH 5.5-6.7，18cm163-2041 IPG预制胶条 pH 6.3-8.3，18cm163-2024 IPG预制胶条 pH 3.9-5.1，11cm163-2025 IPG预制胶条 pH 4.7-5.9，11cm163-2026 IPG预制胶条 pH 5.5-6.7，11cm163-2027 IPG预制胶条 pH 6.3-8.3，11cmIPG预制胶条 pH 3.9-5.1，7cm 163-2028 IPG预制胶条 pH 4.7-5.9，7cm 163-2029 IPG预制胶条 pH 5.5-6.7，7cm 163-2030 IPG预制胶条 pH 6.3-8.3，7cm 163-2031 （二）载体两性电解质（美国Bio-Rad公司），4℃冰箱保存Bio-Lyte 3/10 Ampholyte，40%，10ml 163-1112 Bio-Lyte 3/10 Ampholyte，40%，25ml 163-1113 Bio-Lyte 3/5 Ampholyte，20%，10ml 163-1132 Bio-Lyte 4/6 Ampholyte，40%，10ml 163-1142 Bio-Lyte 4/6 Ampholyte，40%，25ml 163-1143 Bio-Lyte 5/7 Ampholyte，40%，10ml 163-1152 Bio-Lyte 5/7 Ampholyte，40%，25ml 163-1153 Bio-Lyte 6/8 Ampholyte，40%，10ml 163-1162 Bio-Lyte 6/8 Ampholyte，40%，25ml 163-1163 Bio-Lyte 7/9 Ampholyte，40%，10ml 163-1172 Bio-Lyte 8/10 Ampholyte，20%，10ml 163-1182 Bio-Lyte 5/8 Ampholyte，40%，10ml 163-1192 Bio-Lyte 5/8 Ampholyte，40%，25ml 163-1193 （三）等电聚焦上样缓冲液（美国Bio-Rad公司），4℃冰箱保存100×ReadyStrip Buffer，for pH 7-10 IPG Strips，1ml 163-2093 Bio-Lyte 3/10 Ampholyte，100×，1ml 163-2094163-2095 100×ReadyStrip Buffer，for pH 6.8-8.3 IPG Strips，1ml100×ReadyStrip Buffer，for pH 5.5-6.7 IPG Strips，1ml163-2096163-2097 100×ReadyStrip Buffer，for pH 4.7-5.9 IPG Strips，1ml163-2098 100×ReadyStrip Buffer，for pH 3.5-5.1 IPG Strips，1ml1．2 蛋白质定量试剂盒及其试剂Protein Assay Kit I，bovine γ-globulinstandard 500-0001standard 500-0002 Protein Assay Kit II，BSAProtein Standard I，bovine γ-globulin，1bottle 500-0005500-0006 Protein Assay Dye Reagent Concentrate，450mlbottle500-0007 Protein Standard II，bovine serum albumin，1standard500-0121 RC DC Protein Assay Kit I，bovine γ-globulin500-0122 RC DC Protein Assay Kit II，BSAstandard1．3 试剂盒及其试剂ReadyPrepExtractionKit 163-2100 SequentialTributylphosphine（TBP），200mM，0.6ml 163-2101163-2102 ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 1，1vial163-2103 ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 2，1vial163-2104 ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 3，1vialKit 163-2105 StarterReadyPrep2-DReadyPrep 2-D Starter Kit Rehydration/Sample Buffer 163-2106DTT 163-2107 ReadyPrep Starter Kit Equilibration Buffer I，withBufferIIEquilibration163-2108 ReadyPrepStarterKitIodoacetamide，30g 163-2109E.coli Protein Sample，lyophilized，2.7mg163-2110 ReadyPrep Overlay Agarose，50ml 163-2111 1．4 化学试剂尿素Urea，250g 161-0730 尿素Urea，1kg 161-0731Resin 142-6425 AG 501-X8（D）MixedBedCHAPS，1g 161-0460 CHAPSO，1g 161-0465 Triton X-100，500ml 161-0407 DTT（Dithiothreitol），1g 161-0610 DTT（Dithiothreitol），5g 161-0611Tributylphosphine（TBP），200mM，0.6ml 163-2101 溴酚蓝（Bromophenol Blue），10g 161-0404 矿物油（Mineral Oil），500ml 163-2129 SDS，25g 161-0300 SDS，100g 161-0301 SDS，1kg 161-0302 Tris，100g 161-0715 Tris，500g 161-0716 Tris，1kg 161-0719Iodoacetamide，30g 163-2109 低熔点琼脂糖，25g 161-3111161-0717 甘氨酸，250g甘氨酸，1kg 161-0718甘氨酸，2kg 161-0724丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，100g 161-0100 丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，500g 161-0101 丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，2kg 161-0103 丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，1kg 161-0107 丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，5kg 161-0108 甲叉双丙烯酰胺（Bis），5g161-0200 甲叉双丙烯酰胺（Bis），50g 161-0201161-0202 PDA（Piperazine Diacrylamide），10g161-0203 PDA（Piperazine Diacrylamide），50g过硫酸氨（Ammonium Persulfate），10g 161-0700161-0754 过硫酸氨（Ammonium Persulfate），100gTEMED，5ml 161-0800TEMED，50ml 161-0801 甘油国产或Sigma 硫尿Sigma1．5 蛋白质Marker2-D SDS-PAGE Standards，500μl161-0320161-0303 SDS-PAGE Standards，high range，200μlSDS-PAGE Standards，low range，200μl 161-0304161-0317 SDS-PAGE Standards，broad range，200μlPolypeptide SDS-PAGE Standards，200μl 161-0326 Precision Protein Standards，unstained，1500μl，150 applications 161-0362Precision Protein Standards，prestained，500μl，50 applications 161-0372161-0325 Kaleidoscope Polypeptide Standards，500μlKaleidoscope Prestained Standards，broad range，500μl 161-0324161-0309 Prestained SDS-PAGE Standards，high range，500μlPrestained SDS-PAGE Standards，low range，500μl161-0305 Prestained SDS-PAGE Standards，broad range，500μl 161-0318 IEF Standards，pI range 4.45-9.6，250μl 161-0310 1．6 染色试剂Coomassie Brilliant Blue R-250，10g161-0400161-0406 Coomassie Brilliant Blue G-250，10gIEF Gel Staining Solution，1L 161-0434 Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions Kit 161-0435Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions，1L 161-0436161-0437 Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions，4×1L161-0438 Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solutions，1LCoomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solutions，4×1L 161-0439 Bio-Safe Coomassie Stain，1L 161-0786 Bio-Safe Coomassie Stain，5L 161-0787 SYPRO Ruby Protein Gel Stain，200ml 170-3126 SYPRO Ruby Protein Gel Stain，1L 170-3125 SYPRO Ruby Protein Gel Stain，5L 170-3138 Silver Stain Kit 161-0443Kit 161-0450 PlusSilverStain1．7 注意事项1.双向电泳中所用的化学试剂纯度要高，至少为分析级。
双向电泳的原理及步骤
双向电泳的原理及步骤
双向电泳是一种分离蛋白质的方法，基于蛋白质在电场中的电荷和大小的不同进行分离。
以下是双向电泳的原理及步骤：
原理：
双向电泳是将蛋白质样品首先进行等电聚焦，然后再进行垂直于等电聚焦方向的SDS-PAGE电泳，从而获得更高的分离效率。
等电聚焦可以将蛋白质按照等电点的不同进行分离，而SDS-PAGE电泳可以将蛋白质按照分子量的大小进行分离。
通过这两个步骤的组合，可以更加准确地分离出蛋白质。
步骤：
1. 等电聚焦：将蛋白质样品加入到等电聚焦电极中，该电极包含有一系列等电点缓冲液。
在等电聚焦过程中，电极会产生一个电场，该电场会将带有不同电荷的蛋白质分子朝向不同方向移动，最终在等电点处停留。
这样可以将蛋白质按照等电点的不同进行分离。
2. SDS-PAGE电泳：在等电聚焦完成后，将电极旋转90度，使其与等电聚焦电极垂直。
然后将电极中的蛋白质样品注入到SDS-PAGE凝胶中，并进行电泳。
在SDS-PAGE电泳中，蛋白质会在电场中移动，但由于SDS的存在，蛋白质会被完全线性化。
这样可以将蛋白质按照分子量的大小进行分离。
3. 结果分析：通过电泳分离，可以得到一系列不同的蛋白质带，每个带代表一个蛋白质。
通过比对蛋白质带的大小和位置，可以鉴定蛋白质的分子量和等电点，从而确定蛋白质的特征。
蛋白质组双向电泳原理及实验步骤
胶条的平衡
冰箱中取出的胶条，于室温放置10分钟。 配制胶条平衡缓冲液 I 。 吸去胶条上的矿物油及多余的样品。 第一次平衡。振荡15分钟。 配制胶条平衡缓冲液 II 。 第二次平衡 ，振荡15分钟。
吸去玻璃板中液体。将玻璃板倒扣在桌面上。
琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制1×电泳缓冲液。
快速
任意时间
l l l
选择所放置的胶条数。 设置每根胶条的极限电流。（30-50A/根） 设置等电聚焦时的温度。（17℃）
配制SDS-PAGE凝胶
配制 12% 的丙烯酰胺凝胶，直接用双向电 泳专用梳子；或在上部留 0.5cm 的空间， 用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封胶。 聚合30分钟。 待凝胶凝固后，拔去梳子，用MilliQ水冲 洗；或倒去分离胶表面的乙醇或水饱和正 丁醇，用MilliQ水冲洗，备用。
PDQuest软件分析（Software analysis）
质谱鉴定（Protein identification）
样品制备基本原则：
• 使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态，制 备方法应具有可重现性。 • 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 • 防止样品制备过程中发生样品抽提后的化学修饰。 • 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 • 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而 保证待研究蛋白的可检测性。
等电聚焦的 操作
等 电 聚 焦 程 序 的 设 置
7c 1000V 4000V 4000V 慢速 快速 线性 快速
12小时（17℃） 被动水化
30分钟 60分钟 3小时 24,000伏小时 ~28,000伏小时 除盐 除盐 升压 聚焦
S5
500V 保持
双向电泳实验流程
双向电泳实验流程样品制备( Sample preparation ) 固相预制胶条的水化( IPG strip rehydration ) 第一向等电聚焦( IEF)胶条的平衡( IPG strip equilibration )第二向SDS-PAG电泳(SDS-PAGE electrophresis )凝胶的染色及检测( Detection/Staining )PDQuest软件分析(Software analysis )质谱鉴定( Protein identification )目录第一章实验材料1．1 IPG 预制胶条及载体两性电解质1．2 蛋白质定量试剂盒及其试剂1．3 蛋白样品制备试剂盒及其试剂1．4 化学试剂1．5 蛋白质Marker1．6 染色试剂1．7 注意事项第二章SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳2. 1 溶液的配制2. 2 SDS-PAGE 凝胶的配制2. 3 操作方法2. 4 注意事项ATy -_*双向电泳3. 1 溶液配制3. 2 操作步骤3. 3 注意事项附录1 双向电泳完整的操作步骤附录2 聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配置附录3 细胞样品的一般处理步骤附录4组织样品的一般处理步骤第一章实验材料1．1 IPG 预制胶条及载体两性电解质Bio-Rad公司），-20 C冰箱保存，每包12根一）IPG 预制胶条（美国项目规格货号原价（元）IPG 预制胶条pH 3-10 ，7 cm 163-2000 799 IPG 预制胶条pH 3-10 ，7 cm ，nonlinear （NL）163-2002 799 IPG 预制胶条pH 4-7 ，7 cm 163-2001 799 IPG 预制胶条pH 3-6 ，7 cm 163-2003 799 IPG 预制胶条pH 5-8 ，7 cm 163-2004 799 IPG 预制胶条pH 7-10 ，7 cm 163-2005 799 IPG 预制胶条pH 3.9-5.1 ，7cm 163-2028 799 IPG 预制胶条pH 4.7-5.9 ，7cm 163-2029 799 IPG 预制胶条pH 5.5-6.7 ，7cm 163-2030 799 IPG 预制胶条pH 6.3-8.3 ，7cm 163-2031 799 IPG 预制胶条pH 3-10 ，11cm 163-2014 957 IPG 预制胶条pH 3-10 ，11cm，nonlinear （NL）163-2016 957 IPG 预制胶条pH 4-7 ，11cm 163-2015 957 IPG 预制胶条pH 3-6 ，11cm 163-2017 957 IPG 预制胶条pH 5-8 ，11cm 163-2018 957 IPG 预制胶条pH 7-10 ，11cm 163-2019 957 IPG 预制胶条pH 3.9-5.1 ，11cm 163-2024 957 IPG 预制胶条pH 4.7-5.9 ，11cm 163-2025 957 IPG 预制胶条pH 5.5-6.7 ，11cm 163-2026 957 IPG 预制胶条pH 6.3-8.3 ，11cm 163-2027 957 IPG 预制胶条pH 3-10 ，17cm 163-2007 1079 IPG 预制胶条pH 3-10 ，17 cm ，nonlinear （NL ）163-2009 1079 IPG 预制胶条pH 4-7 ，17cm 163-2008 1079 IPG 预制胶条pH 3-6 ，17cm 163-2010 1079 IPG 预制胶条pH 5-8 ，17cm 163-2011 1079 IPG 预制胶条pH 7-10 ，17cm 163-2012 1079 IPG 预制胶条pH 3.9-5.1 ，17cm 163-2020 1079IPG 预制胶条pH 4.7-5.9 ，17cm 163-2021 1079 IPG 预制胶条pH 5.5-6.7 ，17cm 163-2022 1079 IPG 预制胶条pH 6.3-8.3 ，17cm 163-2023 1079 IPG 预制胶条pH 3-10 ，18cm 163-2032 1079 IPG 预制胶条pH 3-10 ，18cm，nonlinear （NL ）163-2033 1079 IPG 预制胶条pH 4-7 ，18cm 163-2034 1079 IPG 预制胶条pH 3-6 ，18cm 163-2035 1079 IPG 预制胶条pH 5-8 ，18cm 163-2036 1079 IPG 预制胶条pH 7-10 ，18cm 163-2037 1079 IPG 预制胶条pH 3.9-5.1 ，18cm 163-2038 1079 IPG 预制胶条pH 4.7-5.9 ，18cm 163-2039 1079 IPG 预制胶条pH 5.5-6.7 ，18cm 163-2040 1079 IPG 预制胶条pH 6.3-8.3 ，18cm 163-2041 1079 IPG 预制胶条pH 3-10 ，24cm 163-2042 1292 IPG 预制胶条pH 3-10 ，24cm，nonlinear （NL ）163-2043 1292 IPG 预制胶条pH 4-7 ，24cm 163-2044 1292 IPG 预制胶条pH 3-6 ，24cm 163-2045 1292 IPG 预制胶条pH 5-8 ，24cm 163-2046 1292 IPG 预制胶条pH 7-10 ，24cm 163-2047 1292 IPG 预制胶条pH 3.9-5.1 ，24cm 163-2048 1292 IPG 预制胶条pH 4.7-5.9 ，24cm 163-2049 1292 IPG 预制胶条pH 5.5-6.7 ，24cm 163-2050 1292 IPG 预制胶条pH 6.3-8.3 ，24cm 163-2051 1292（二）载体两性电解质（美国Bio-Rad公司），4C冰箱保存项目货号原价（元）Bio-Lyte 3/10 Ampholyte ，40%，10ml 163-1112 1704 Bio-Lyte 3/10 Ampholyte ，40%，25ml 163-1113 2463 Bio-Lyte 3/5 Ampholyte ，20%，10ml 163-1132 3275 Bio-Lyte 4/6 Ampholyte ，40%，10ml 163-1142 3713 Bio-Lyte 4/6 Ampholyte ，40%，25ml 163-1143 9287 Bio-Lyte 5/7 Ampholyte ，40%，10ml 163-1152 2984 Bio-Lyte 5/7 Ampholyte ，40%，25ml 163-1153 7540 Bio-Lyte 6/8 Ampholyte ，40%，10ml 163-1162 3569 Bio-Lyte 6/8 Ampholyte ，40%，25ml 163-1163 8187Bio-Lyte 7/9 Ampholyte，40%，10ml 163-1172 3479 Bio-Lyte 8/10 Ampholyte ，20%，10ml 163-1182 1912Bio-Lyte 5/8Ampholyte，40%，10ml 163-1192 3275Bio-Lyte 5/8Ampholyte，40%，25ml 163-1193 8114（三）等电聚焦上样缓冲液（美国Bio-Rad 公司），4C冰箱保存项目货号原价（元）100x ReadyStrip Buffer , for pH 7-10 IPG Strips , 1ml 163-2093 744Bio-Lyte 3/10 Ampholyte , 100x, 1ml 163-2094 396100x ReadyStrip Buffer ，for pH 6.8-8.3 IPG Strips ，1ml 163-2095566 100x ReadyStrip Buffer ，for pH 5.5-6.7 IPG Strips ，1ml 163-2096 774100x ReadyStrip Buffer ，for pH 4.7-5.9 IPG Strips ，1ml 163-2097 545100x ReadyStrip Buffer ，for pH 3.5-5.1 IPG Strips ，1ml 163-20985921．2 蛋白质定量试剂盒及其试剂项目货号报价（元）Protein Assay Kit I , bovine 丫-globulin standard 500-0001 919Protein Assay Kit II ，BSA standard 500-0002 919Protein Standard I, bovine 丫-globulin , 1 bottle 500-0005429 Protein Assay Dye Reagent Concentrate，450ml 500-0006 690Protein Standard II，bovine serum albumin，1 bottle 500-0007 365Quick Start Protein Assay Kit I ,Bradford 法500-0201 934De Protein Assay Kit I , bovine 丫-globulin standard 500-0111 2281 De Protein Assay Kit n, BSA standard 500-0112 2281 RC DC Protein Assay Kit I , 丫-globulin , Lowry 法500-0121 3183 RC DC Protein Assay Kit II , BSA standard , Lowry 法500-0122 31831．3 蛋白样品制备试剂盒及其试剂项目Ready-Prep 2-D Cleanup KitReadyPrep Sequential Extraction Kit Tributylphosphine （TBP ），200mM ，0.6ml ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 1货号原价（元）163-2130 2533163-2100 2969163-2101 539 1vial 163-2102 1116ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 2 ，1vial 163-2103 909 ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 3 ，1vial 163-2104 646 ReadyPrep 2-D Starter Kit 163-2105 3250 ReadyPrep 2-D Starter Kit Rehydration/Sample Buffer 163-2106 331 ReadyPrep Starter Kit Equilibration Buffer I ，with DTT 163-2107 508 ReadyPrep Starter Kit Equilibration BufferII 163-2108 498E.coli Protein Sample ，lyophilized ，2.7mg 163-2110 446ReadyPrep Overlay Agarose，50ml 163-2111 287 ProteoMiner Protein Enrichment SmallCapacity Kit 163-3006 3699 ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit 163-2007 5618 Aurum Serum Protein Mini Kit 732-6701 1513 Aurum Affi-Gel Blue Mini Columns 732-6708 1873 ReadyPrep Protein Extraction Kit (Cytoplasmic/Nuclear) 163-2089 4919 ReadyPrep Protein Extraction Kit (Membrane I) 163-2088 4919 ReadyPrep Protein Extraction Kit (Membrane II) 163-2084 2986 ReadyPrep Protein Extraction Kit (Signal) 163-2087 28151．4 化学试剂项目尿素Urea，250g 尿素Urea，1kgAG 501-X8 (D)Mixed Bed ResinCHAPS ，1gTriton X-100 ，500mlDTT (Dithiothreitol )，1gDTT (Dithiothreitol )，5g Tributylphosphine ( TBP )，200mM ，0.6ml 碘乙酰胺Iodoacetamide，30g 溴酚蓝( Bromophenol Blue )，10g 矿物油( Mineral Oil )，500ml SDS，100gSDS，1kg Tris ，500g Tris ，1kg 低熔点琼脂糖，25g 甘氨酸，1kg 货号161-0730161-0731142-6425161-0460161-0407161-0610161-0611163-2101163-2109161-0404163-2129161-0301161-0302161-0716161-0719161-3111161-0718原价（元）22268527713904212917315391429501298368199181311511360713甘氨酸，2kg 161-0724 1671 丙烯酰胺(Acrylamide ), 99.9% , 500g 161-0101 919 丙烯酰胺(Acrylamide ), 99.9% , 2kg 161-0103 3411 丙烯酰胺(Acrylamide ), 99.9% , 1kg 161-0107 1870 丙烯酰胺(Acrylamide ), 99.9% , 5kg 161-0108 8514 甲叉双丙烯酰胺（Bis）, 5g 161-0200 294 PDA (Piperazine Diacrylamide ), 10g 161-0202 1902 PDA (Piperazine Diacrylamide ), 50g 161-0203 17361 过硫酸氨(Ammonium Persulfate ), 10g 161-0700 155 过硫酸氨(Ammonium Persulfate )，100g 161-0754 1153 TEMED，5ml 161-0800 207 TEMED，50ml 161-0801 485 甘油Sigma硫尿Sigma1. 5 蛋白质标准品Marker项目货号原价（元）Unstained SDS-PAGE Standards，high range，200 'l 161-0303 689 Unstained SDS-PAGE Standards，low range，200'l 161-0304 689 Unstained SDS-PAGE Standards，broad range，200'l 161-0317 884 Polypeptide SDS-PAGE Standards，200._l 161-0326 692 Prestained SDS-PAGE Standards, high range，500^1 161-0309 689 Prestained SDS-PAGE Standards, low range，500^1 161-0305 689 Prestained SDS-PAGE Standards, broad range，500^1 161-0318 800 Precision Plus Std Unstained，1ml 161-0363 1168 Precision Plus Std Dual Color，500ul 161-0374 1080 2-D SDS-PAGE Standards，500 J 161-0320 1457 IEF Standards，pl range 4.45-9.6，250^1 161-0310 16211. 6染色试剂项目Coomassie Brilliant Blue R-250 , 10gCoomassie Brilliant Blue G-250 , 10gCoomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions Kit Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions ,货号原价（元）161-0400 413161-0406 670161-0435 1440 1L 161-0436 464Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions ，4 X 1L 161-0437 1856 Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solutions ，1L 161-0438 488Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solutions ，4X 1L 161-0439 1952 Bio-Safe Coomassie Stain ，1L 161-0786 878 Bio-Safe Coomassie Stain ，5L 161-0787 3493 SYPRO Ruby Protein Gel Stain ，200ml 170-3126 2226 SYPRO Ruby Protein Gel Stain ，1L 170-3125 5725 SYPRO Ruby Protein Gel Stain ，5L 170-3138 16744Silver Stain Kit 161-0443 3933 Silver Stain Plus Kit （质谱兼容）161-0449 28541．7 注意事项1. 双向电泳中所用的化学试剂纯度要高，至少为分析级，尽量选用进口试剂。
双向电泳完整操作方法
双向电泳完整操作方法蛋白质的变性及其应用在热、酸、碱、重金属盐、紫外线等作用下，蛋白质会发生性质改变而凝结，这种作用就叫做蛋白质的变性。
蛋白质变性后，不仅失去了原来的可溶性，同时也失去了生理活性。
本文主要从影响蛋白质变性作用的因素以及蛋白质变性作用的应用两方面加以论述。
一、温度随着温度的变化，蛋白质的性质也随之变化。
一般说来，在低温时蛋白质的活性较弱，并且温度越低、活性越弱，但在低温时蛋白质一般不发生变性作用；在较高的温度时，蛋白质的活性增强，并且在一定温度范围内，温度越高、活性越强，在加热（或高温）时，蛋白质活性丧失，发生变性作用。
因此，我们可通过控制温度，来控制蛋白质的性质向着有利于我们需要的方面进行。
例如：1。
低温冷冻、冷藏。
许多含蛋白质的物质，如蛋类、肉类、鱼类等长久放置时会在某些微生物（或细菌）的作用下发生腐败。
根据在低温时微生物（或细菌）活动性较弱的性质，可以用冰箱、冷库等将这些物质贮存较长的时间。
同理，一些含水量高的食品，如水果、疏菜等可冷藏贮存。
2。
有酶参与的各种发酵作用，如酿酒、酿醋、制酱等，都要控制适宜的温度。
温度太高，酶发生变性作用，发酵停止；温度太低，酶的活性减弱，发酵速度减慢，甚至停止。
根瘤菌的固氮作用是在室温下进行的。
3。
作物浸种、菌种疏菜（如蘑菇、灵芝）等的生长、豆芽的生长、鸡鸭等禽蛋的孵化等都要控制适宜的温度，温度过高或过低效果都不好。
4。
在日常生活中，为了减少疾病，防止各种病菌对人体的侵害，一般不要喝生水，不要吃未煮熟的食物，因为这里面的一些细菌、病菌没有经高温杀死。
夏天，有时如果稀饭、汤菜等做多了，可将多余的饭菜重新煮沸后放置在锅里，由于整个锅内的细菌已被杀死，因此短时间内饭菜不会变质。
当衣服上沾有鲜血斑时，宜用温水洗，千万不能用热水洗，否则，会引起蛋白质凝固，沾附在纤维上难以洗净。
5。
在医疗卫生、公共场所中的应用。
在医院里当病人因皮肤破裂引起出血时，医生常用冰块将出血的部位冷冻起来，其作用主要有：①使血管收缩，减少出血；②使表面的血凝固，阻止内部的血液流出；③降低病菌的活性，防止感染。
蛋白质双向电泳实验流程
蛋白质双向电泳实验流程一．样品制备1.研磨研磨时间要尽量短，并需及时补充液氮，研磨要充分，同时要保证损失少。
2.加入8mLTris饱和酚（pH8.8）和8mL抽提液，在通风橱内研磨30s。
先加8mLTris饱和酚，Tris饱和酚会变成固体，此时需用研磨碓将固体的Tris饱和酚研磨成小块。
接着加入8mL抽提液，也需将固体的抽提液研磨成小块。
等三者混匀后，将粉末转移至45 mL tube。
3.振荡30min。
室温静置，待tube中固体变成液体后，开始振荡。
振荡需持续30min，每振荡1min，置于冰上冷却1min。
4.10000g，4℃，10min。
将酚相（top phase）转移至45mL tube。
酚相（top phase）可置于冰上。
酚相应该是绿色的，水相应该是淡黄色的。
5.取6mL的抽提液和6mL饱和酚加入水相，蜗旋振荡30min。
振荡需持续30min，每振荡1min，置于冰上冷却1min。
6.10000g，4℃，10min。
将酚相（top phase）转移至45mL tube。
7.沉淀酚相。
取一定体积（是酚相的5倍）的0.1M乙酸铵/甲醇溶液（–20℃保存）于酚相（45mL tube）。
振荡30s，–20℃培育1h或过夜。
8.清洗沉淀①15 min，20,000 g，4℃。
弃上清。
②加10mL 0.1 M乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。
–20℃沉淀30min。
③15 min，20,000 g，4℃。
弃上清。
④加入10 mL乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。
–20℃沉淀30min。
⑤15 min，20,000 g，4℃。
弃上清。
⑥加10mL 80%丙酮（ice-cold)，用移液器吸打。
–20℃沉淀30 min。
⑦15 min，20,000 g，4℃。
弃上清。
⑧加入10 mL 80%丙酮(ice-cold)，用移液器吸打。
–20℃沉淀30 min。
⑨15 min，20,000 g，4℃。
弃上清。
双向电泳步骤--标准操作完整版
细胞裂解（蛋白质提取）一、试剂配置：PBS配方PBS缓冲液一般作为溶剂氯化钠(MW 58.44) 130mM 8g氯化钾(MW 74.5) 2.7mM 0.2g十二水和磷酸氢二钠(MW 358) 10 mM 3.63g磷酸二氢钾(MW 136) 2 mM 0.24g加水至1L配好后进行高压灭菌。
Washing buffer（500mL）配方Tris（MW 121.1） 10mM 0.605g蔗糖（MW 342） 250mM 42.75g加水溶解，用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22µm滤膜过滤（使用1M盐酸略高于2750uL调pH）裂解储液配方（细胞）：尿素(MW 60.06) 7M 4.2g硫脲(MW 76.12) 2M 1.52gCHAPS(MW614.89) 4%（W/V）0.4g 加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。
裂解储液配方（组织）：尿素(MW 60.06) 5M 3g硫脲(MW 76.12) 2M 1.52gCHAPS(MW614.89) 2% 0.2gTris（MW 121.1） 40mM 0.048g加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。
裂解液：裂解液储液 100uLIPG buffer（pH可选） 2% 2uLPi 2uLNucLease mix（100×） 1uLPMSF（100mM：20mg/mL） 1mM 1uLDTT（0.411g/mL） 40mM 1.5uLPi：每片使用200uL超纯水溶解后按10 uL分装考马斯亮蓝G-250：考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比。
双向电泳原理及实验步骤
样品上样缓冲液
标准溶液：
Reagent
Amount
8M urea
50mM DTT or 2mM TBP 4% CHAPS
47ml of 8.5 stock or 24g urea in 25ml H2O 385mg or 500ul of 200mM TBP stock
2g
0.2%carrier ampholytes
– 必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸 等物质的去除；
– 保证样品在电泳过程中保持溶解状态。
双向电泳原理及实验步骤
增加样品溶解性的手段
离液剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展， 将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。 典型代表是尿素和硫尿。
去垢剂：经过离液剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后， 还常需至少一种去垢剂来溶解疏水基团。常用的去垢 剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和 NP-40、两性离子去垢剂CHAPS、OBG等。其中 CHAPS应用最普遍。
溶液中的蛋白
混合肽
肽指纹图
肽序列质谱数据 蛋白质质量 N端测序
数据搜索 新的或已知蛋白 蛋白双向转电泳录原后理及修实验饰步的骤 鉴定
一、双向电泳的实验原理
双向电泳原理及实验步骤
第一向：等电聚焦
+
pH 3
+
pH 3
pH 7.5 pH 7.5
–
pH 10
–
pH 10+ຫໍສະໝຸດ pH 3pH 7.5
+
pH 3
pH 7.5 双向电泳原理及实验步骤
第二向：SDS-PAGE电泳
–
Proteins migrate through the gel at a rate proportional to their size.
二维电泳详细过程
北京六一仪器厂DYCZ-26C双向电泳系统检测报告技术部吴承疆QQ:50894034实验原理：双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，已得到广泛应用。
这项技术利用蛋白质的两种特性，分两步将不同的蛋白质分离。
第一向步骤为等电聚焦（IEF），即根据蛋白质的等电点（pI）差异将蛋白质分离。
第二向步骤为十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），即利用蛋白质的分子量（Mr, 相对分子量）差异将蛋白质分离。
双向凝胶电泳结果中的每个斑点都对应着样本中的一种蛋白。
因此，可将上千种不同的蛋白质分离开来，并得到每种蛋白质的等电点、表观分子量等信息。
实验方法：一.实验材料:1.主要仪器和试剂（sigma,Ampholine购自GE）主要试剂超纯水（MiLiQ）、尿素(Urea)、硫脲(Thiourea)、二硫苏糖醇（Dithiothreitol，DTT）、CHAPS（3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐）、Ampholine（PH 3-10或4-7 5-8）碘乙酰胺(Iodoacetamide，IAA)、EDTA-Na2（乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid）、十二烷基磺酸钠（Sodium Dodecylsulphate，SDS）、溴酚蓝(Bromophenol Blue)、低熔点琼脂糖、过硫酸铵(Ammonium Persulfate APS)、TEMED（四甲基乙二胺）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺；Tris碱、甘氨酸、硝酸银、无水碳酸钠、无水乙酸钠、硫代硫酸钠、甲醛、无水乙醇、冰醋酸、氢氧化钠、磷酸、甘油（丙三醇 glycerin ）、牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）、蛋白质marker、蛋白定量试剂盒主要仪器DYCZ-26C、DYY-16D、DYY-6D、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、0.1毫克级电子分析天平、超声波细胞破碎仪、Millipore纯水仪(法国)、Eppendorf 普通离心机、beckman高速冷冻离心机、瞬时离心机、恒温磁力搅拌器、UMAX 扫描仪(台湾)；恒温摇床、pH计、恒温振荡器等。
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附：双向电泳完整的操作步骤
（一）第一向等电聚焦
1. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室温溶解。
2. 在小管中加入0.01g DTT，Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml，充分混匀。
3. 从小管中取出400ml水化上样缓冲液，加入100ml样品，充分混匀。
4. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17cm pH 4-7），室温中放置10分钟。
5. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。
在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。
注意：不要产生气泡。
否则影响到胶条中蛋白质的分布。
6. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。
7. 分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。
确保胶条与电极紧密接触。
不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。
同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。
如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。
8. 在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。
需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
9. 对好正、负极，盖上盖子。
设置等电聚焦程序。
10.聚焦结束的胶条。
立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。
（二）第二向SDS-PAGE电泳
1. 配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。
配80ml凝胶溶液，每块凝胶40ml，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用MilliQ水（没有milliq的话ddh2o也行，注，水云深浪按）、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。
聚合30分钟。
一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。
2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。
3. 从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。
4. 配制胶条平衡缓冲液I。
5．在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。
将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。
这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。
6. 将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I。
将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
7. 配制胶条平衡缓冲液II。
8. 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。
并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。
再加入胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
9. 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。
将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。
10.将琼脂糖封胶液进行加热溶解。
11.将10×电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1×电泳缓冲液。
赶去缓冲液表面的气泡。
12.第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。
并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。
13.将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。
然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。
其余胶条同样操作。
14.将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。
在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。
15.用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。
注意不要在胶条下方产生任何气泡。
在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。
16.放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。
17.在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。
将凝胶转移至电泳槽中。
18.在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/17cm）或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
19.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。
20.进行染色。
等电聚焦电泳（IFE，isoelectric focusing electrophoresis）
利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在聚丙烯酰胺凝胶内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到它的等电点（pI）处，即梯度中的某一pH时，就不再带有净的正或负电荷了。
聚丙烯酰氨凝胶电泳
作用原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，它有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。
而SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。
这个技术首先是1967年由shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二。
三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的蛋白量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，于连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。
电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。
蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。
电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。