聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳

带。
可编辑ppt
4
可编辑ppt
5
2.3.两性电解质 (1) Ampholine(瑞典LKB) 它是由许多脂肪族的多氨基,多羧基的异构体和同系物组 成的, pH范围2.5-4.5，4-6.5，5-8，3.5-9.5.
可编辑ppt
6
(2) Servalyte(德国Serva公司) 它是在由丙烯基乙胺与乙烯基亚胺缩合并蒸馏得到的多胺 混合物中,再引入磺酸基团或磷酸基团合成的. pH范围:2-4, 3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、9-11、2-11、3-10.
如果把A,B二者的混合物放在一个pH3.5-10的pH梯度中的
pH6的位置，则A蛋白质的净电荷为-2,减少两个净电荷；
B蛋白质的净电荷为+2，多了两个净电荷。在相同的电场
下,A移向阳极,B移向阴极，当它们达到净电荷为零时停止
迁移，这种行为称为聚焦反可应编辑。ppt
3
蛋白质在等电聚焦电泳中的分离仅仅决定于其等电点，
可编辑ppt
7
(3) Pharmalyte (瑞典Pharmacia) 七氨基多羧基组成的 pH范围: 2.5-5, 4-5.5, 5-8, 8-10, 3-10 等
可编辑ppt
8
(4)载体两性电解质(军事医学科学院) 合成的方式与Ampholine基本相同. pH范围: 3-9.5, 3.5-5.5, 4.0-6.0, 5.0-7.0, 6.0-9.0, 7.0-10.0
可编辑ppt
17
2、配试剂(每组用量)
（1）固定液100ml
三氯乙酸10g
磺基水杨酸3.5g
95%乙醇35ml
加蒸馏水至100ml
(2)脱色液100 ml
95%乙醇10 ml
冰醋酸7.5 ml
加蒸馏水至100ml 可编辑ppt
18
3、实验步骤 (1) 安装电泳槽,调水平(先平放两块相同厚度玻璃板,上放 塑料模板,一头用铁夹夹住)
A
B
C
可编辑ppt
19
D
E
(2)配凝胶溶液 单体 2ml Ampholine 0.5ml ddH2O 5.5ml TEMED 8μl 10% AP 50μl
可编辑ppt
20
(3)灌胶, 聚胶60分钟 (4)取下玻璃板, 电泳槽上加少许液体石蜡,将坐标纸浸透铺 平整, 坐标纸上放带胶玻璃板 (5)加电极条:取4张滤纸条,其中两张滤纸条浸透1mol/L 磷 酸,另两张浸透1mol/L NaOH, 多余的液滴用滤纸质吸去,然 后对称放在凝胶的两侧.
11
可编辑ppt
12
3.2pH梯度的形成过程 pH梯度形成的时间,视正负电极之间的距离和凝胶的厚度 而定.一般一块长12cm的玻璃,电极间的有效距离为10cm， 凝胶的厚度为1mm，使用Ampholine为载体两性电解质, 电泳1小时后pH梯度基本形成，2小时后无多大变化,如图
可编辑ppt
13
可编辑ppt
可编辑ppt
21
(6)剪取加样纸:
按坐标纸的尺寸,剪成0.5 x 0.5cm大小的加样纸,拨去上
下覆盖的保护纸,取出8层擦镜纸作为加样纸,根据样液浓度
调节加样纸的层数(标准样4层,其它样液均为8层).
(7)加样:
将加样纸分别吸取样液,成一字形排放在两电极之间的
凝胶中央.
(8)连接电极:
将电极线的插头插入电极板的插孔内,盖上电极板,使铂
这是一个”稳态”过程,一旦达到等电点的位置，蛋白质 就会停止迁移。达到稳态后，如果它要正极或负极任何一
侧扩散，均会受到相应的pH制约，即若向负极扩散带负 电,会受到阳极的影响，迫使其扩散后退回原位;若向正极 扩散带正负电,会受到阴极的影响，迫使其扩散后退回原 位。因此，蛋白质能在等电点位置被聚焦成一条稳定的窄
可编辑ppt
10
(1)靠近阳极端的载体两性电解质,电负性最强,具有较强的 缓冲氢离子的能力,使环境的pH等于载体两性电解质的pI, 一直向阴极顺延; (2)靠近阴极端的载体两性电解质,电正性最强,具有较强的 缓冲氢氧根离子的能力,使环境的pH等于载体两性电解质 的pI,一直向阳极顺延。如图
可编辑ppt
14
可编源自文库ppt
15
4、实验流程 等电聚焦凝胶溶液配制
↓
安装电泳槽、调水平
↓ 铺胶
↓ 加样
↓ 电泳
↓ 停止电泳
↓ 取胶固定
↓
染色、脱色
可编辑ppt
16
二、实验方法 1、仪器准备及清洗 (1)电泳槽,玻璃板三块, 塑料模板 (2)烧杯 50 ml 一个 (3)量筒100ml一个
10 ml一个 (4)大培养皿 一个
可编辑ppt
2
2.2.等电聚焦
在常规电泳中,通常只是在恒定的缓冲液中进行分离，假
定有A, B两个蛋白质组分，分别带有净电荷-3和+1。在一
个pH9的缓冲洗脱中,带负电荷的蛋白质均放在靠阴极一侧
电泳,此时带负电荷多的A蛋白质受阳极影响大,泳动速度比
B快,最终会超过B，这样二者就会得到分离。
在等电聚焦电泳中，分离是在连续的pH梯度中进行的。
可编辑ppt
9
3 pH梯度的形成 3.1在电场下载体两性电解质的变化 在没有电场时,载体两性电解质溶液的pH值大约是该溶液 pH范围的平均值(如pH3-10的载体两性电解质溶液,其pH 约为6.5左右)。所以载体两性电解质分子都带有电荷,只是 在溶液中的正电荷和负电荷数目相等,净电荷为零. 引入电 场时,载体两性电解质分子分别向阴极和阳极移动,最终在 分子净电荷为零的位置停止迁移.
取出凝胶,浸泡在40ml的固定液中 摇动约30min,倾出固
定液.再加入60ml的固定液过夜.
(11)染色:
倾出固定液,用蒸馏水漂洗一次,加入考马斯亮蓝R250溶
聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳
一、实验简介 1、实验目的
聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳实验，初步掌握聚焦电泳 的基本原理和实验技术
可编辑ppt
1
2、基本原理 2.1蛋白质的等电点 蛋白质属于一种两性电解质.在不同的pH环境中所带的正 负电荷不同。若在某特定的pH环境中其净电荷为零,此时 的pH为该蛋白质的等电点。在电场下不泳动。
金丝压在电极条上.盖上安全可编罩辑p,p接t 通冷凝水.
22
(9)电泳:
将电泳仪正极输出端与磷酸电极条相连, 负极输出端与
NaOH电极条相连,接通电源,60V恒压15min, 8mA恒流至
电压上升到 550V,关闭电源,揭去加样纸, 然后在550V恒
压3小时左右,等电流降至接近于零,停止电泳.
(10)固定: