流式细胞仪原理及应用
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FSC SSC FL1 FL2 Event 1 30 60 638 840 Event 2 100 160 245 85 Event 3 300 650 160 720
数据显示: 直方图 ( Histogram ) 二维点图(Dot Plot) 等高线图(Contour Plot) 密度图 (Density) 三维图（3D Plot）等
外周全血细胞散射光双参数点图
（红细胞溶解后）
荧光信号
双色直接染色
数据分析
直方图分析
数据分析
点图分析
数据分析
等高图和密度图分析
数据分析
三维图分析
当前生产流式细胞仪的公司
• BD公司 • 贝克曼-库尔特公司 • Cytomation公司 • Bio-Rad 公司 • Partec公司（德国） • Applied Biosystems公司
光信号检测 散射光信号
Laser
FALS Sensor
Incident Light
Source
Right Angle Light Detector
Cell Complexity
SSC
Forward Light Detector Cell Surface Area
FSC
前向角散射光（FSC, Forward Scatter）
鞘流系统
流动室
鞘液
荧光信号 聚焦的激光光束
Injector Tip
鞘流原理 鞘流公式
Re= dρv／η
Re为雷诺（Reynolds）系数，d 为管道直径，v 为液体流速，密度为ρ ，黏滞系数为η。
当Re<2300时，液体处于稳流状态， 当Re ﹥2300时，液体处于湍流状态。
数据处理分析转换
数据存储: LIST MODE
细胞功能
细胞表面/胞浆/核的特异 性抗原
细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体
当前流式细胞分析发展趋势
从相对细胞计数到绝对细胞计数 从相对定量到绝对定量分析 从单色到多色荧光分析 从细胞膜成分到细胞内成分分析 从细胞分析到可溶性成分的流式细胞分析
流式细胞术的基本概念
• CD:是cluster of differentiation 的缩写，指的是分化 群或分化簇，即将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的 同一分化抗原归为一个分化群，每一CD分子代表一种或一 类分化抗原。
• Antibody：抗体是能与抗原特异性结合并具有免疫活性的 球蛋白。它一般是由抗原刺激B细胞分化成浆细胞后产生的 。抗体分子具有结合部位(结合簇)，能与对应的抗原决定 簇结合。抗体与不同的抗原结合往往出现不同的反应，因 而常给抗体以不同的名称，如凝集素、沉淀素、抗毒素、 溶血素、溶菌素等。
光电二极管
荧光补偿原理
• 颜色补偿：采用合适的方法校正荧光染料之间叠加 所造成的误差。在完成双色以上荧光标记的样本时 ，都需要作颜色补偿。
• 带通滤片接受的是一定带宽波长的荧光，故会有干 扰光同时被接收，然后一同进入PMT进行光电转换 并放大。
• 通常干扰光占该染料所发出荧光总量的X%
补偿模型图
流式细胞术的特点
极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够， 流式细胞仪（Flow cytometer）可以每秒钟数十、数百、数 千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万 乃至数百万个。
可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针， 如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色， 通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚 群的识别、计数更为准确。
定性或定量分析细胞：通过荧光染色对单细胞的某些成分如 DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度、酶活性以及细胞的 功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析
强大的分选功能，在分析的同时可以对特定群体加以分选
流式细胞仪的检测范围
细胞结构
细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量
流式细胞仪原理 及其应用
流式细胞仪的原理
流式细胞术的基本概念
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一 种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微 粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技 术，同时可以对特定群体加以分选;研究对象多 为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微 球等；研究的微粒特性包括多种物理及生物学特 征，并加以定量。
流式细胞仪的组成
• 光学系统 • 鞘流系统 • 电子系统 • 计算ห้องสมุดไป่ตู้系统 • 数据转换处理系统
光学系统：
激发光源：弧光灯和激光两大类
• 激光优点：稳定性好、能量高、发散角小； • 激光分类：气体激光器、染料激光器、半导体激光器 • 气体激光器：氩离子激光（488nm）
氪离子激光（647nm） 氦-氖激光（633nm） • FACSCaliburTM 采用了氩离子激光（488nm）和波长为 635nm的半导体激光器。
细胞相对大小及其表面积
侧向角散射光（SSC, Side Scatter）
细胞粒度及细胞内相对复杂性
光信号检测
荧光信号
• 使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析 • 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量
光信号检测
常见荧光染料的发射波长
光信号收集
• 分光镜 • 滤光镜：长通（LP）
短通（SP） 带通（BP） • 光电信号转换：光电倍增管（PMT）
BD公司简介
• BD公司是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S. Dickinson 于1897年在纽约创立的,总部位于美 国新泽西州
流式细胞术的基本概念
• Fluorescein ：荧光素，是指在一定波长的电 磁波（常为蓝光或紫外光）照射下能发出荧光 的一类染料 ；常见的荧光素有异硫氰酸荧光素 ( fluorescein isothiocyanate, FITC)、藻红 蛋白（R-Phycoerythrin,R-PE）、别藻青蛋白 （allophycocyanin,APC）、多甲藻叶绿素蛋白 （ peridinin chlorophyll protein, PerCP） 等。
数据显示: 直方图 ( Histogram ) 二维点图(Dot Plot) 等高线图(Contour Plot) 密度图 (Density) 三维图（3D Plot）等
外周全血细胞散射光双参数点图
（红细胞溶解后）
荧光信号
双色直接染色
数据分析
直方图分析
数据分析
点图分析
数据分析
等高图和密度图分析
数据分析
三维图分析
当前生产流式细胞仪的公司
• BD公司 • 贝克曼-库尔特公司 • Cytomation公司 • Bio-Rad 公司 • Partec公司（德国） • Applied Biosystems公司
光信号检测 散射光信号
Laser
FALS Sensor
Incident Light
Source
Right Angle Light Detector
Cell Complexity
SSC
Forward Light Detector Cell Surface Area
FSC
前向角散射光（FSC, Forward Scatter）
鞘流系统
流动室
鞘液
荧光信号 聚焦的激光光束
Injector Tip
鞘流原理 鞘流公式
Re= dρv／η
Re为雷诺（Reynolds）系数，d 为管道直径，v 为液体流速，密度为ρ ，黏滞系数为η。
当Re<2300时，液体处于稳流状态， 当Re ﹥2300时，液体处于湍流状态。
数据处理分析转换
数据存储: LIST MODE
细胞功能
细胞表面/胞浆/核的特异 性抗原
细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体
当前流式细胞分析发展趋势
从相对细胞计数到绝对细胞计数 从相对定量到绝对定量分析 从单色到多色荧光分析 从细胞膜成分到细胞内成分分析 从细胞分析到可溶性成分的流式细胞分析
流式细胞术的基本概念
• CD:是cluster of differentiation 的缩写，指的是分化 群或分化簇，即将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的 同一分化抗原归为一个分化群，每一CD分子代表一种或一 类分化抗原。
• Antibody：抗体是能与抗原特异性结合并具有免疫活性的 球蛋白。它一般是由抗原刺激B细胞分化成浆细胞后产生的 。抗体分子具有结合部位(结合簇)，能与对应的抗原决定 簇结合。抗体与不同的抗原结合往往出现不同的反应，因 而常给抗体以不同的名称，如凝集素、沉淀素、抗毒素、 溶血素、溶菌素等。
光电二极管
荧光补偿原理
• 颜色补偿：采用合适的方法校正荧光染料之间叠加 所造成的误差。在完成双色以上荧光标记的样本时 ，都需要作颜色补偿。
• 带通滤片接受的是一定带宽波长的荧光，故会有干 扰光同时被接收，然后一同进入PMT进行光电转换 并放大。
• 通常干扰光占该染料所发出荧光总量的X%
补偿模型图
流式细胞术的特点
极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够， 流式细胞仪（Flow cytometer）可以每秒钟数十、数百、数 千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万 乃至数百万个。
可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针， 如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色， 通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚 群的识别、计数更为准确。
定性或定量分析细胞：通过荧光染色对单细胞的某些成分如 DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度、酶活性以及细胞的 功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析
强大的分选功能，在分析的同时可以对特定群体加以分选
流式细胞仪的检测范围
细胞结构
细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量
流式细胞仪原理 及其应用
流式细胞仪的原理
流式细胞术的基本概念
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一 种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微 粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技 术，同时可以对特定群体加以分选;研究对象多 为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微 球等；研究的微粒特性包括多种物理及生物学特 征，并加以定量。
流式细胞仪的组成
• 光学系统 • 鞘流系统 • 电子系统 • 计算ห้องสมุดไป่ตู้系统 • 数据转换处理系统
光学系统：
激发光源：弧光灯和激光两大类
• 激光优点：稳定性好、能量高、发散角小； • 激光分类：气体激光器、染料激光器、半导体激光器 • 气体激光器：氩离子激光（488nm）
氪离子激光（647nm） 氦-氖激光（633nm） • FACSCaliburTM 采用了氩离子激光（488nm）和波长为 635nm的半导体激光器。
细胞相对大小及其表面积
侧向角散射光（SSC, Side Scatter）
细胞粒度及细胞内相对复杂性
光信号检测
荧光信号
• 使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析 • 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量
光信号检测
常见荧光染料的发射波长
光信号收集
• 分光镜 • 滤光镜：长通（LP）
短通（SP） 带通（BP） • 光电信号转换：光电倍增管（PMT）
BD公司简介
• BD公司是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S. Dickinson 于1897年在纽约创立的,总部位于美 国新泽西州
流式细胞术的基本概念
• Fluorescein ：荧光素，是指在一定波长的电 磁波（常为蓝光或紫外光）照射下能发出荧光 的一类染料 ；常见的荧光素有异硫氰酸荧光素 ( fluorescein isothiocyanate, FITC)、藻红 蛋白（R-Phycoerythrin,R-PE）、别藻青蛋白 （allophycocyanin,APC）、多甲藻叶绿素蛋白 （ peridinin chlorophyll protein, PerCP） 等。