第4讲 基因工程药物实例
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指标： ≤0.1%
（7）生物活性测定
本实验检测目 的蛋白对成纤 维细胞是否有 增殖作用
Biological activity assay
（8）内毒素含量测定
内毒素：是多种革兰氏阴性菌的细胞壁成分，由菌 体裂解后释出的毒素，又称之为“热原”。
本实验主要考察纯化样品 （原液）本身对鲎试剂是否 有干扰，同时检测样品的内 毒素含量范围 （ ≤50EU/mg ）。
利用PCR扩增目的基因
2、重组载体的构建
目的基因
NdeI
SalI
目的基因与pET30a(+)连接重组
3、转化子筛选——（含卡那霉素的抗性平板）
4、工程菌的表达——IPTG诱导
目的蛋白条带
5、表达产物的纯化
目的蛋白（20 kD）
纯化后的蛋白电泳图谱
重组蛋白大规模制备工艺流程
6、产品的质量检测
常用检测指标与方法：
杂质和污染物
内毒素 宿主细胞蛋白 其它蛋白杂质 残余DNA 蛋白变异 甲酰蛋氨酸 蛋氨酸氧化 产物变性或聚和脱氨基
检测方法
鲎试剂、家兔热原法 免疫分析、SDS-PAGE、CE 免疫分析、SDS-PAGE、 HPLC、CE DNA杂交、紫外光谱、蛋白结合 肽谱、HPLC、 IEF、 CE 肽谱、HPLC、 IEF、 CE 肽谱、HPLC、 质谱、氨基酸分析 SDS-PAGE、IEF、HPLC、 CE、质谱、 凝胶过滤
12
杂质和污染物
单克隆抗体 氨基酸取代 微生物 支原体 病毒
检测方法
SDS-PAGE、免疫分析 氨基酸分析、肽谱、质 谱、CE 微生物学检查 微生物学检查 微生物学检查
（1）纯度及分子量测定
SDS-PAGE检测分子量
HPLC检测纯度
14
（2）原液肽图分析
对照品肽图 原液肽图
（3）等电点分析
（4）Western-blotting分析
（5）残留菌体DNA分析——DNA杂交
非蛋白类杂质主要有: 病毒、细菌等微生物、热原、 内毒素、致敏源及DNA。
指标：≤10ng/mg
（6）残留菌体蛋白分析——ELISA法
超量的菌体蛋白会引起严重的过敏反应。
本实验采用抗大肠杆菌菌体蛋白抗 体和HRP－抗大肠杆菌菌体蛋白抗 体，经ELISA法测定。
基因工程药物的高回报
• 碱性成纤维细胞生长因子 231元/g
• 红细胞生成素
1072元/ g
• 白细胞介素-2
410元/ g
• 巨细胞粒细胞集落刺激因子 1960元/ g
• 胰岛素
10.2元/mg
基因工程药物制备的主要程序:
⒈目的基因的克隆
⒉构建DAN重组体 ⒊DAN重组体转入宿主菌
上游技术
课后问题?
大家查一下如何测定原液中的蛋白浓度? 有哪 几种方法可以测定?
谢谢聆听！
Fra Baidu bibliotek
⒋构建高表达工程菌
⒌工程菌发酵（发酵工艺建立）
⒍产物的分离纯化（纯化工艺建立） 下游技术
⒎产品的检验等（质量标准的建立）
5
二、基因工程药物生产实例
1、目的基因克隆
本实例中，以生 产某一表皮细胞 生长因子为例 （基因大小为： 513 bp，编码 170个氨基酸， 分子量大小为 19.3 kD)
1M
目的基因 （513 bp）
Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery
一、回顾一下基因工程操作步骤
1、重组DNA技术操作步骤
目的基因的获取 克隆载体的选择和构建
外源基因与载体的连接 DNA导入受体菌
重组体的筛选
克隆基因的表达
基因工程药物生产
胰岛素、生长激素、干扰素、白细胞介 素、乙肝疫苗、单抗、表皮生长因子等五十 余种药物，通过基因工程实现工业化生产， 均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平 发挥了重大的作用。
（7）生物活性测定
本实验检测目 的蛋白对成纤 维细胞是否有 增殖作用
Biological activity assay
（8）内毒素含量测定
内毒素：是多种革兰氏阴性菌的细胞壁成分，由菌 体裂解后释出的毒素，又称之为“热原”。
本实验主要考察纯化样品 （原液）本身对鲎试剂是否 有干扰，同时检测样品的内 毒素含量范围 （ ≤50EU/mg ）。
利用PCR扩增目的基因
2、重组载体的构建
目的基因
NdeI
SalI
目的基因与pET30a(+)连接重组
3、转化子筛选——（含卡那霉素的抗性平板）
4、工程菌的表达——IPTG诱导
目的蛋白条带
5、表达产物的纯化
目的蛋白（20 kD）
纯化后的蛋白电泳图谱
重组蛋白大规模制备工艺流程
6、产品的质量检测
常用检测指标与方法：
杂质和污染物
内毒素 宿主细胞蛋白 其它蛋白杂质 残余DNA 蛋白变异 甲酰蛋氨酸 蛋氨酸氧化 产物变性或聚和脱氨基
检测方法
鲎试剂、家兔热原法 免疫分析、SDS-PAGE、CE 免疫分析、SDS-PAGE、 HPLC、CE DNA杂交、紫外光谱、蛋白结合 肽谱、HPLC、 IEF、 CE 肽谱、HPLC、 IEF、 CE 肽谱、HPLC、 质谱、氨基酸分析 SDS-PAGE、IEF、HPLC、 CE、质谱、 凝胶过滤
12
杂质和污染物
单克隆抗体 氨基酸取代 微生物 支原体 病毒
检测方法
SDS-PAGE、免疫分析 氨基酸分析、肽谱、质 谱、CE 微生物学检查 微生物学检查 微生物学检查
（1）纯度及分子量测定
SDS-PAGE检测分子量
HPLC检测纯度
14
（2）原液肽图分析
对照品肽图 原液肽图
（3）等电点分析
（4）Western-blotting分析
（5）残留菌体DNA分析——DNA杂交
非蛋白类杂质主要有: 病毒、细菌等微生物、热原、 内毒素、致敏源及DNA。
指标：≤10ng/mg
（6）残留菌体蛋白分析——ELISA法
超量的菌体蛋白会引起严重的过敏反应。
本实验采用抗大肠杆菌菌体蛋白抗 体和HRP－抗大肠杆菌菌体蛋白抗 体，经ELISA法测定。
基因工程药物的高回报
• 碱性成纤维细胞生长因子 231元/g
• 红细胞生成素
1072元/ g
• 白细胞介素-2
410元/ g
• 巨细胞粒细胞集落刺激因子 1960元/ g
• 胰岛素
10.2元/mg
基因工程药物制备的主要程序:
⒈目的基因的克隆
⒉构建DAN重组体 ⒊DAN重组体转入宿主菌
上游技术
课后问题?
大家查一下如何测定原液中的蛋白浓度? 有哪 几种方法可以测定?
谢谢聆听！
Fra Baidu bibliotek
⒋构建高表达工程菌
⒌工程菌发酵（发酵工艺建立）
⒍产物的分离纯化（纯化工艺建立） 下游技术
⒎产品的检验等（质量标准的建立）
5
二、基因工程药物生产实例
1、目的基因克隆
本实例中，以生 产某一表皮细胞 生长因子为例 （基因大小为： 513 bp，编码 170个氨基酸， 分子量大小为 19.3 kD)
1M
目的基因 （513 bp）
Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery
一、回顾一下基因工程操作步骤
1、重组DNA技术操作步骤
目的基因的获取 克隆载体的选择和构建
外源基因与载体的连接 DNA导入受体菌
重组体的筛选
克隆基因的表达
基因工程药物生产
胰岛素、生长激素、干扰素、白细胞介 素、乙肝疫苗、单抗、表皮生长因子等五十 余种药物，通过基因工程实现工业化生产， 均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平 发挥了重大的作用。