第 4 章 GB2随机突变噬菌体文库的构建及淘选

第 4 章 GB2随机突变噬菌体文库的构建及淘选 用 B-Domain 蛋白作为亲和材料纯化抗体时，由于其与 IgG 结合能力较强，在用于抗体纯化的洗脱过程中，洗脱条件苛刻，需要 pH2.4 的洗脱缓冲液，这种极端条件会很大程度地破坏抗体的活性，从而影响所纯化抗体的使用价值。而 B-Domain 用于抗体的定向固定时，则是其抗体结合力越强，越有利于定抗体的定向固定。噬菌体展示技术作为一种分子体外进化技术，经常应用于蛋白质或多肽的改造。鉴于此，本文构建了 GB2 的随机突变文库，首先是采用易错 PCR 将 GB2 进行随机突变，将突变 PCR 产物克隆至噬菌粒 pHEN I 中，然后用电转化的方式，将连接产物转化至 E.coli TG1 中，构建了 mtGB2 的随机突变文库，用 M13K07 辅助噬菌体感染 TG1 文库，得到 mtGB2 的噬菌体展示文库。以 IgG 为淘选靶分子，对文库进行两个方向的淘选，一个是淘选在 pH4.0 的洗脱缓冲液中能被洗脱的突变型，能更好地应用于抗体纯化领域；一个是在 pH2.4 仍不能被洗脱的突变型，能更好地应用于抗体的定向固定。

pHENI-GB2

400 bp mt-GB2

图4-1 GB2 随机突变载体文库的构建示意图 Fig.4-1 Schematic of construct the random mutation library of of pHEN-mtGB2

pH6.0

洗脱

缓冲液洗脱淘选多轮

淘选多轮

图4-2亲和力减弱文库 A 淘选过程示意图 Fig. 4-2 Schematic of the panning of library A

图4-3 亲和力增强文库 B 淘选过程示意图

Fig. 4-3 Schematic of the panning of library B

4.1 材料、仪器与试剂

4.1.1材料

E.coli TG1 购自Invitorgen、噬菌粒pHEN I、Help phage M13K07 由英国剑桥医学研究委员会(MRC) 分子生物学实验室Greg Winter 博士惠赠；小鼠腹水由本实验室制备。

4.1.2主要仪器

—BIO-RAD 凝胶成像系统BIO-RAD 公司

—低温离心机（2K-15）Sigma 公司

—PCR 扩增仪（Gene Amp PCR system 2400型）PE 公司

—型稳压电泳仪（DYY-I Ⅲ）北京六一仪器厂

—超低温冰箱（CD-196/HC）Thermo 公司

—电转仪Bio-Rad 公司

—电击杯Bio-Rad 公司

—超纯水制备仪（67120）美国Millipore公司

—恒温摇床上海智诚

—96 孔酶标板美国Costar 公司

—37℃恒温孵育箱日本SANYO

—型全自动灭菌锅（MLS-3750）日本SANYO 公司

—酶联免疫检测仪（MK2）Labsystems 公司

4.1.3试剂

Taq DNA 聚合酶、脱氧核糖核苷酸（dNTPs）、限制性内切酶（XhoⅠ、NcoⅠ、SalⅠ）、DL2000 DNA marker、λ-HindⅢDNA marker，DNA 片段纯化试剂盒、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、质粒提取试剂盒均购买与TaKaRa 公司；T4 DNA ligase 购自NEB公司；Goldview 核酸染料购自博大泰克生物基因技术有限责任公司；Yeast extract、Tryptone 购自Oxoid 公司；其他普通化学药品与试剂都是国产分析纯。

4.1.4 溶液与培养基

1）LB：在900 mL 蒸馏水中加10 g Tryton，5 g Yeast Extract，10 g NaCl，溶解

后加水至一升，用NaOH 调节pH 至7.4；

2）SOB 培养基：20 g/L Trypone，5 g/L Yeast Extract，0.5 g/L NaCl，高压冷却至55℃后加入1 mol/L 的无菌MgCl2 10 mL，250 mmol/L KCl 10 mL；

3）SOC 培养基：除含有20 mmol/L 葡萄糖外，其他成分与SOB 培养基相同；4）SOB 平板：4 g 胰蛋白胨，1 g 酵母膏，0.1 g NaCl，0.188 g KCl，2.03 g MgCl2，0.986 g MgSO4，3.6 g 琼脂粉，加ddH2O 至200 mL，高压灭菌，冷却后加入200 µL 100 mg/mL 氨苄青霉素，混匀后立即铺平皿，4℃保存备用。

5）2×YT：在900 mL ddH2O 中加16 g 胰蛋白胨，10 g 酵母膏，5 g NaCl，加ddH2O 至1 L，调节pH 至7.0，高压灭菌备用。

6）2×YT-G：2×YT 培养基中加入2% 的葡萄糖；

7）2×YT-AG：2×Y-GT 培养基中加入100 µg/mL 的氨苄青霉素；

8）2×YT-AK：2×YT 培养基中加入100 µg/mL 的氨苄青霉素和50 µg/mL 的卡那霉素；

9）上层琼脂：每升10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母膏，5 g NaCl，1gMgCl2.6H2O，7 g 琼脂粉，融化后分装试管 3 mL/管，高压灭菌，用时用微波炉融化，每加入10µL 2M的MgCl2。

10）PEG-NaCl：20％（w/v）PEG 8000，称量200 g PEG 8000，146.1 g NaCl，溶解于800 mL 去离子水中，定容至 1 L，高压灭菌，室温储存。

11）PBS：称取NaCl 8.0 g，KH2PO4 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 2.9 g，KCl 0.2 g，加蒸馏水定容至1000 mL。

12）洗涤缓冲液PBST：称取NaCl 8.0 g，KH2PO4 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 2.9 g，KCl 0.2 g，加蒸馏水定容至1000 mL，再加入Tween-20 0.5 mL。

13）0.1 M Gly-HCl（pH2.4、4.0、6.0）：称取0.75 g Gly，溶解于与100 mL 去离子水中，用HCl 溶液分别将pH 调节至pH2.4、4.0、6.0。

14）1 M Tris-HCl(pH9.0)称取12.1 g Tris，溶解于去离子水中，定容至100 mL，调节pH至9.0。

4.2 实验方法与步骤

4.2.1 野生型pHEN I-wtGB2 质粒的构建

1）合成引物

pHEN-GB2-Nco I：GCACCATGG ca ACTTACAAATTAATCCTTAATGG (Nco I)