基因工程5章基因与载体的连接课件
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基因工程5章基因与载体的连接课件
当载体和外源DNA片段两端的酶切位点之间，不可能 找到恰当的匹配时，解决方法：
⑴人工接头连接法：通过依次加入、连接合成DNA接 头，再用限制酶切加以解决。
⑵同聚物加尾连接法：可以利用末端转移酶分别在 载体酶切位点处和外源DNA片段的3’端加上相互补 的同聚尾加以解决。
⑶PCR法：通过PCR(聚合酶链反应)技术扩增外源DNA 片段，从而加上合适的限制性内切酶的单一识别序 列，再用限制酶切加以解决。
2020/9/25
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一是作为领导干部一定要树立正确的 权力观 和科学 的发展 观，权 力必须 为职工 群众谋 利益， 绝不能 为个人 或少数 人谋取 私利
三、平端连接法 适用于限制性内切酶切割产生的平端 适用于粘端补齐或切平形成的平端
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一是作为领导干部一定要树立正确的 权力观 和科学 的发展 观，权 力必须 为职工 群众谋 利益， 绝不能 为个人 或少数 人谋取 私利
3、基因克隆： 是指将外源基因与有自主复制能力的载体
DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA 分子的过程，又称为分子克隆。 4、基因亚克隆： 是指将较大的克隆片段经酶切后，再将所有 的小DNA片段与另一个载体连接转化的过程。
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一是作为领导干部一定要树立正确的 权力观 和科学 的发展 观，权 力必须 为职工 群众谋 利益， 绝不能 为个人 或少数 人谋取 私利
G
+ CCTAG
G
CCTAG
GATCC G
GATCC G
T4 DNA连接酶
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
15ºC
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
⑴人工接头连接法：通过依次加入、连接合成DNA接 头，再用限制酶切加以解决。
⑵同聚物加尾连接法：可以利用末端转移酶分别在 载体酶切位点处和外源DNA片段的3’端加上相互补 的同聚尾加以解决。
⑶PCR法：通过PCR(聚合酶链反应)技术扩增外源DNA 片段，从而加上合适的限制性内切酶的单一识别序 列，再用限制酶切加以解决。
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三、平端连接法 适用于限制性内切酶切割产生的平端 适用于粘端补齐或切平形成的平端
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3、基因克隆： 是指将外源基因与有自主复制能力的载体
DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA 分子的过程，又称为分子克隆。 4、基因亚克隆： 是指将较大的克隆片段经酶切后，再将所有 的小DNA片段与另一个载体连接转化的过程。
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G
+ CCTAG
G
CCTAG
GATCC G
GATCC G
T4 DNA连接酶
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
15ºC
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
I目的基因与载体的连接课件
二、连接前的处理
为了将目的基因重组于载体分子之中，需要将载 体DNA和目的基因分别进行适当处理，使其可以互 相连接，形成新的重组分子。 1.对载体的要求： 一般采用限制性内切酶法将载体DNA分子切割成可 与外源基因连接的线性分子.载体DNA通常有着许 多酶切位点．但是并不是所有的酶切位点都可用于 重组切割，理想的酶切位点应该符合下列几个条件: 1） 位于载体上特定的酶切位点要尽可能少,最好是 单一酶切位点,这样才能保证目的基因和载体DNA 以最高的几率正确组合.
(2) 对某一基因的上游序列进行调控机能分析， 则需考虑选择适当的报告基因，并将可能
3
一 是 作 为 领 导干部 一定要 树立正 确的权 力观和 科学的 发展观 ，权力 必须为 职工群 众谋利 益，绝 不能为 个人或 少数人 谋取私 利
具有调控机能的目的基因置于报告基因 的上游适当位置。 ➢ 若调控基因可能有增强子（其特点一 是位置变化大、二是其作用无明显方 向性）作用，还应在报告基因下游适 当部位设计一个插入位点，以插入一 个功能基因，由此反映增强子的作用。
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一 是 作 为 领 导干部 一定要 树立正 确的权 力观和 科学的 发展观 ，权力 必须为 职工群 众谋利 益，绝 不能为 个人或 少数人 谋取私 利
2、连接前的准备：
依不同的研究目的而定，认真设计最终构 建的重组体分子。需要考虑下列2个方面。 如果研究目的是：
(1) 表达有价值的蛋白质，要考虑选用适当的启 动子、增强子等调节序列和终止序列，要将目 的基因置于启动子的转录起始点的下游，并审 视“阅读框”是否正确，这些对表达融合蛋白 至关重要。
屈艾制作
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一 是 作 为 领 导干部 一定要 树立正 确的权 力观和 科学的 发展观 ，权力 必须为 职工群 众谋利 益，绝 不能为 个人或 少数人 谋取私 利
为了将目的基因重组于载体分子之中，需要将载 体DNA和目的基因分别进行适当处理，使其可以互 相连接，形成新的重组分子。 1.对载体的要求： 一般采用限制性内切酶法将载体DNA分子切割成可 与外源基因连接的线性分子.载体DNA通常有着许 多酶切位点．但是并不是所有的酶切位点都可用于 重组切割，理想的酶切位点应该符合下列几个条件: 1） 位于载体上特定的酶切位点要尽可能少,最好是 单一酶切位点,这样才能保证目的基因和载体DNA 以最高的几率正确组合.
(2) 对某一基因的上游序列进行调控机能分析， 则需考虑选择适当的报告基因，并将可能
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一 是 作 为 领 导干部 一定要 树立正 确的权 力观和 科学的 发展观 ，权力 必须为 职工群 众谋利 益，绝 不能为 个人或 少数人 谋取私 利
具有调控机能的目的基因置于报告基因 的上游适当位置。 ➢ 若调控基因可能有增强子（其特点一 是位置变化大、二是其作用无明显方 向性）作用，还应在报告基因下游适 当部位设计一个插入位点，以插入一 个功能基因，由此反映增强子的作用。
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一 是 作 为 领 导干部 一定要 树立正 确的权 力观和 科学的 发展观 ，权力 必须为 职工群 众谋利 益，绝 不能为 个人或 少数人 谋取私 利
2、连接前的准备：
依不同的研究目的而定，认真设计最终构 建的重组体分子。需要考虑下列2个方面。 如果研究目的是：
(1) 表达有价值的蛋白质，要考虑选用适当的启 动子、增强子等调节序列和终止序列，要将目 的基因置于启动子的转录起始点的下游，并审 视“阅读框”是否正确，这些对表达融合蛋白 至关重要。
屈艾制作
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大学生物化学课件基因工程ppt
定义 识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围 切割双链DNA的一类内切酶。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
切割DNA后产生含5’磷酸和3’羟基的末端
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
连接酶
重组体
转化 体外包装，转染
带重组体的宿主
筛选
表型筛选
酶切电泳鉴定
菌落原位杂交
以 质 粒 为 载 体 的
DNA 克 隆 过 程
扩增或表达
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
（六）克隆基因的表达
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
平端切口
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
GTC CAG
蛋白质而特意设计的载体称为表达载体。
载体的选择标准：
能在宿主细胞中自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体
的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有
多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 作为表达载体，具有与宿主细胞相适应的
调控元件：启动子，增强子等。
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
切割DNA后产生含5’磷酸和3’羟基的末端
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
连接酶
重组体
转化 体外包装，转染
带重组体的宿主
筛选
表型筛选
酶切电泳鉴定
菌落原位杂交
以 质 粒 为 载 体 的
DNA 克 隆 过 程
扩增或表达
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（六）克隆基因的表达
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
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平端切口
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
GTC CAG
蛋白质而特意设计的载体称为表达载体。
载体的选择标准：
能在宿主细胞中自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体
的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有
多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 作为表达载体，具有与宿主细胞相适应的
调控元件：启动子，增强子等。
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基因工程研究PPT课件
基因工程研究
体外 操作 与细 胞内 表达
(基因工程技术包括下列过程)
分─获取目的基因和载体 接─目的基因与载体的连接 转─重组DNA导入宿主细胞 筛─重组DNA的筛选 鉴─重组DNA的鉴定
可用以上五个字表示
(一)目的基因的分离(分)
目的基因:是指所要研究或应用的基因,也是需要克隆或表达 的基因。 (一) 目的基因的分离 1、基因分离的策略
同 源 多 聚 尾 连 接 法
三、将重组体导入受体细胞 (转)
根据受体生物,可将重组体导入受体细胞的方法主要分为大肠杆 菌转化法、酵母转化法、植物细胞转化法及动物细胞转化法
(一) 大肠杆菌转化法 1、氯化钙转化法(狭义的转化)或转染 感受态细胞(Competent Cell)的制备:用特殊方法处理,使细胞膜通透 性增加,从而具有摄取外源DNA的能力。 转化流程:感受态细胞和重组DNA混合,使DNA与钙离子形成复合物, 吸附于细胞表面,经42℃短暂(90s)的热处理,促进外源DNA进入感受态 细胞。
(三) 植物细胞转化法
1、农杆菌质粒介导法 农杆菌介导法是目前双子叶植物基因转移的常用方法。
它是利用根癌农杆菌的Ti (Tumor induce)质粒和发根农杆 菌的Ri (Root induce)质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染 植物形成肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细胞并插 入到染色体基因中。利用Ti质粒的这一天然的遗传转化特性, 可将外源基因置换T-DNA中的非必需序列即可使外源基因整 合到受体染色体而获得稳定的表达。
4、同源多聚尾连接法
也称作人工接尾连接法 当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断,无 法得到相同得粘性末端时,可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平,再在末端核 苷酸转移酶的催化下,将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的 基因的3'-端,如载体上添加一段polyG,则可在目的基因上添 加一段polyC,故二者即可通过碱基互补进行粘合,再由DNA连 接酶连接。
体外 操作 与细 胞内 表达
(基因工程技术包括下列过程)
分─获取目的基因和载体 接─目的基因与载体的连接 转─重组DNA导入宿主细胞 筛─重组DNA的筛选 鉴─重组DNA的鉴定
可用以上五个字表示
(一)目的基因的分离(分)
目的基因:是指所要研究或应用的基因,也是需要克隆或表达 的基因。 (一) 目的基因的分离 1、基因分离的策略
同 源 多 聚 尾 连 接 法
三、将重组体导入受体细胞 (转)
根据受体生物,可将重组体导入受体细胞的方法主要分为大肠杆 菌转化法、酵母转化法、植物细胞转化法及动物细胞转化法
(一) 大肠杆菌转化法 1、氯化钙转化法(狭义的转化)或转染 感受态细胞(Competent Cell)的制备:用特殊方法处理,使细胞膜通透 性增加,从而具有摄取外源DNA的能力。 转化流程:感受态细胞和重组DNA混合,使DNA与钙离子形成复合物, 吸附于细胞表面,经42℃短暂(90s)的热处理,促进外源DNA进入感受态 细胞。
(三) 植物细胞转化法
1、农杆菌质粒介导法 农杆菌介导法是目前双子叶植物基因转移的常用方法。
它是利用根癌农杆菌的Ti (Tumor induce)质粒和发根农杆 菌的Ri (Root induce)质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染 植物形成肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细胞并插 入到染色体基因中。利用Ti质粒的这一天然的遗传转化特性, 可将外源基因置换T-DNA中的非必需序列即可使外源基因整 合到受体染色体而获得稳定的表达。
4、同源多聚尾连接法
也称作人工接尾连接法 当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断,无 法得到相同得粘性末端时,可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平,再在末端核 苷酸转移酶的催化下,将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的 基因的3'-端,如载体上添加一段polyG,则可在目的基因上添 加一段polyC,故二者即可通过碱基互补进行粘合,再由DNA连 接酶连接。
基因工程载体植物基因工程优秀课件
载体的概念
载体（vector) • 基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩
增和表达的工具称为载体。
目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持 高效表达，在很大程度上决定于载体 。
载体的功能
载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 为外源基因提供整合能力
载体的要求
质粒
受体细胞 E.coli
结构 环状
插入片断 ＜ 8kb
举例 pUC18/19 , pBR322等
λ噬菌体载体 丝状噬菌体及噬菌粒载体
E.coli E.coli
线状 环状
粘粒载体载体
E.coli
环状
BAC (Bacterial Artificial Chromosome)载体
YAC (Yeast Artificial chromosome )载体
遗传物质 + 载体
为什么要用到载体？
Байду номын сангаас
重组的DNA分子
引入细胞或生物体内
复制与表达
稳定地遗传给下代
基因工程流程图
为什么需要载体？ 1）独立的一个包括启动子（promoter)、编码区 （encoding region)和终止子（terminator)的基因，or 组成 基因的某个元件，一般是不可以进入受体细胞的； 2）采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维持。
EMBL系列， λ gt系列 M13mp系列
pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
pBeloBAC11
pYAC4
pCXLamIntWT, pCXLamIntR and pCXLamIntROK SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
第五章 目的基因与载体连接 2
第五章目的基因与载体的连接内容提要•基因重组克隆与亚克隆•基因重组对载体的要求与载体类型•连接前的处理•黏性末端连接•平端连接•人工接头连接•同聚寡核苷酸末端连接第一节基因重组克隆与亚克隆外源基因的获取载体的选择与构建外源基因与载体的切割与修饰外源基因与载体的连接（DNA体外重组）目的基因的表达重组DNA导入受体细胞重组体的筛选体外重组就是指目的基因与载体DNA的连接。
基因重组是靠DNA连接酶将适当切割的DNA即目的基因与载体共价连接。
DNA连接酶能催化相邻或两侧的DNA上裂口核苷酸裸露的3’-羟基和5’-磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的DNA裂口连接起来。
在分子克隆中中，最有用的连接酶是来自于T4噬菌体的DNA连接酶——T4连接酶，该酶需要ATP作为辅助因子。
注意：在连接之前，应结合研究目的基因的特性，来设计最终构建的重组体分子。
一、体外连接重组DNA的特点1、DNA体外连接减少了DNA分子进入宿主细胞后遭受降解的危险，增加了转化效率；2、由于限制性内切酶产生的黏端在体外连接，使原来酶的识别序列在整个DNA维持完整性，有利于在重组子转化扩增以后再对外源基因的分离；3、连接时可以控制连接反应条件，有利于形成环状分子或者几个DNA片段头尾相连接的直线多联体。
基因重组克隆实质上就是DNA体外重组以及后续的转化过程。
亚克隆是指把DNA片段从某一类型载体无性繁殖到另一类型载体的过程。
例如：重组λ-噬菌体质粒亚克隆通常是将较大的克隆片段经酶切后，再将所有的小DNA片段与另一个载体连接转化的程序。
注意：进行连接反应时，要考虑载体DNA与DNA片段的比率。
例如：以自质粒载体形成环状分子，1：1。
以λ噬菌体或cos质粒为载体，形成多联体分子，二者的比例相应的就高些。
第二节基因重组对载体的要求与载体类型根据重组连接的目的，可将载体分为克隆载体和表达载体。
一、克隆载体如果所进行的重组连接暂时不考虑表达量的问题，只是为目的基因的获得或使该基因克隆、亚克隆或扩增、构建DNA文库，可以选择一般的克隆型载体。
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二、粘性末端连接法
(1)单酶切位点的粘端连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接
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由于限制性内切酶产生的粘性末端在体外连接，使 原来酶的识别序列在整个DNA维持完整性，有利 于在重组子转化扩增以后再对外源基因的分离。
连接时可以控制连接反应条件，有利于形成环状分 子或者几个DNA片段头尾相连接的直线多联体。
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一是作为领导干部一定要树立正确的 权力观 和科学 的发展 观，权 力必须 为职工 群众谋 利益， 绝不能 为个人 或少数 人谋取 私利
一、概述
1、DNA体外重组：
将目的DNA、载体DNA 和DNA连接酶在试管中 进行的实验操作过程。
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2、DNA体外重组的特点：
DNA体外连接减少了DNA分子进入宿主细胞后遭 受降解的危险，增加了转化效率。
3、基因克隆： 是指将外源基因与有自主复制能力的载体
DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA 分子的过程，又称为分子克隆。 4、基因亚克隆： 是指将较大的克隆片段经酶切后，再将所有 的小DNA片段与另一个载体连接转化的过程。
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A G A T C T T C T A G A
AATTC G
EcoRⅠ+ Bg lⅡ
双酶切
A TCTAG
AATTC G
GATCT A
GAATTC CTTAAG
AGATCT TCTAGA
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+AATTC G
A TCTAG
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T4 DNA连接酶 15ºC
双酶切片段
⑵不同限制酶切位点（配伍末端）的连接
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⑶不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接
Eco RⅠ切割位点
G A A T T C C T T A A G
Bg lⅡ切割位点2020/9 Nhomakorabea255
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G
+ CCTAG
G
CCTAG
GATCC G
GATCC G
T4 DNA连接酶
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
15ºC
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
目的基因自连
GGATCC CCTAGG
重组体
GGATCC CCTAGG
载体基因自连
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第五章
基因与载体的连接
一、概述 二、粘性末端连接法 三、平端连接法 四、人工接头连接法 五、同聚物加尾连接法
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GAATTC CTTAAG
的定向克隆
AGATCT TCTAGA
重组体
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定向克隆：
使外源DNA ( 目的 基因 ) 片段定向插 入到载体分子的克 隆方案。
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5、载体DNA酶切位点具备的条件
位于载体上特定的酶切位点要尽可能少，最好是 单一酶切位点，这样能保证目的基因和载体DNA 以最高的概率正确组合。
在酶切位点之前要有一个较强的启动子，使插入 的目的基因可在该启动子的指导下高效表达。
选择的载体必须在连接重组对基因转录和翻译过 程中的编码区读框不改变。
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如 何 防 止 载 体 自 连 呢
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⑴单酶切位点的粘性末端连接
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GGATCC CCTAGG
Bam HⅠ切割反应
G CCTAG
GATCC G
目的基因用 Bam HⅠ切割
载体DNA用Bam HⅠ切割
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定向克隆的优点：
①外源DNA只能以一个方向定向插入到重组质粒， 以便目的基因的正确转录和表达。
②质粒载体与外源DNA结合处的限制性内切酶位 点仍然保留，可随时从重组载体中通过相应的限 制性内切酶切割后分离和获得目的基因。