凋亡相关基因Bax表达产物检测

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实验结果
缺糖前 HeLa 细胞
缺糖 24h HeLa细胞
缺糖 48Fra Baidu bibliotek HeLa 细胞
缺糖前 PC 12细胞
缺糖 24 h PC 12细胞
缺糖 48 h PC 12细胞
注意事项
吸弃及加液时要注意不要将细胞吹起 一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强
度有直接关系。 染色时间要控制好,及时以蒸馏水终止反
SABC
antigen
器材与试剂
仪器:移液枪、枪头、滴管、显微镜、湿盒 材料:培养细胞 试剂:甲醇、PBS、封闭液、一 抗、 二抗、
SABC、DAB 、0.3%H2O2-PBS DMEM培养液(10%小牛血清的高糖、无糖) 顺铂(20、 40umol/l )
试 剂说明
PBS: 磷酸盐缓冲液(0.01M,PH7.2) 封闭液:5% 牛血清白蛋白(BSA,即用型) 一 抗: 小鼠IgG(抗小鼠、抗大鼠、抗人),用 时PBS稀释 二抗: 山羊抗小鼠IgG(生物素化) SABC (avidin-biotin-peroxidase complex ) :
实验步骤
培养细胞(96孔板,每组正常、缺糖损伤、两个浓度药物 损伤各2孔)
吸弃培养液,PBS洗,3次 (轻轻摇动后吸弃,小心) 甲醇固定5min PBS洗,3次(同上)(加时用吸管,吸时用枪,以后同) 加入封闭液25µl,37 ℃,30min,吸去上清液 加一抗25µl,37 ℃,1-2h后置4℃冰箱过夜(每组各3孔) PBS洗,3次 加二抗(1ml PBS加入生物素化山羊抗小鼠IgG 10µl)25µl,
37 ℃,1h PBS洗,3次
实验步骤
加0.3% H2O2-PBS(30-50µl),37 ℃,30min PBS洗,3次 SABC工作液(即用型)25µl,37 ℃,30min PBS洗,3次 DAB显色:
DAB显色工作液配制(现配):用三蒸馏水稀释 DAB显色液(20倍),混匀后加至96孔板(2530µl/孔),镜下控制,以蒸馏水终止反应。 观察结果
链霉亲和素对生物分子有极高的亲和力,是一 般抗原抗体亲和力的一百万倍,其对组织和细 胞的非特异吸附很低,该方法背景很低。
SABC大约可以形成一百万个左右的过氧化物酶 和五十个左右的链霉亲和素所构成的复合物
SABC具有很高的敏感性、低背景和操作简便的 优点。
(avidinbiotinperoxidase complex )
链酶亲和素—生物素—过氧化物酶复合物 DAB(diaminobenzidine)显色液试剂盒:
( 3,3´-二氨基联苯胺、TBS、 H2O2 )
课前操作
周二下午接种细胞 96孔板(每组8孔) 正常、缺糖损伤、两浓度药物损伤各2孔
周三中午损伤(6孔) 周四中午固定、加封闭液(正常、缺糖
损伤、两浓度药物损伤各1孔,共4孔), 30分钟后加一抗 周五中午加二抗
实验(三)
凋亡相关基因-Bax的表达产物的检测
实验原理
免疫细胞化学(免疫组化)是将抗原、抗体 间的免疫反应引入细胞标本,并通过对其 所带有的特殊标记物的显示,籍以对细胞 内某抗原或抗体作定性、定位以及定量检 测。
链霉亲和素—生物素—过氧化酶复合物技 术(SABC技术)
其特点是利用链霉亲和素分别连接生物素标记 的第二抗体和生物素标记的酶。
应,以免染色太深影响观察
下次实验内容
家系分析、传代细胞染色体标本的 制备
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