高速逆流色谱操作

高速逆流色谱操作步骤和要点

操作步骤：

1 配液。超声脱气约20min，脱气后静置冷却至室温后泵液。

2 打开恒温水浴，将温度升至设定温度。

3 泵固定相。以10-20mL/min流速泵入固定相，检测器出口端流出固定相约20-50 mL后停泵。

4 平衡。打开紫外检测器开始预热，正转转动主机至900 rpm（FWD为正转，REV 为反转），同时以3 mL/min流速泵入流动相，至出口端流出流动相且此时紫外信号稳定，体系基本己平衡。

5 进样。以体系的上、下相溶解一定量的样品，超声溶解均匀后，在装样注射器中倒入样品溶液，将进样六通问切换至load，推排气泡后吸液至样品全进入进样圈中，将load切换至inject，检测器、工作站调零开始记录。

6 接收流分。工作站记录，设备运行时间为如5 min，保存后采集数据，保存。7清洗。断开泵与主机的连接，将主机进口与气管出口连接，吹气；将主机中溶剂吹出后，泵入约50 mL清洗液，吹气，重复此过程2~3次；最后一次长时间（1小时左右直至吹干）吹气时将主机内液体吹尽。

8 关机。

操作要点：

本仪器适用于有机溶剂，316L不锈钢及PTFE材料可耐受的酸碱溶液。

1 本设备可承受的压力限制为

2 MPa，请勿泵入不可溶解的固体颗粒。

2 设备运行前先检查连接管路是否正确，是否紧密；检测器波长是否正确。

3 配液时溶剂应混合均匀，自然分层澄清后可超声脱气，脱气时间不宜过长，脱气后如溶剂有温热则最好冷却静置至室温后使用。

4 样品溶解可为体系上相或下相，或同时两相溶解；不可以单一的溶剂来溶解进样，以免破坏主机内的体系平衡。

5 每次做完实验请及时清洗设备，一般清洗液为甲醇、乙醇等，如体系内含有酸、碱、盐等溶剂，建议先以纯净水清洗l~2次后，再以清洗液清洗。

6 日常清洗完设备后；如需继续进行实验，请设备放置2小时后重新平衡。

7 操作中如有气泡、流失或其他异常现象，可致电上海同田生物技术有限公司技术支持部

2

附件1：仪器性能检验

苯酚、间苯二酚的分离

体系：正已烷：乙酸乙酯：乙醇：水=1：1：1.2：0.8

把溶剂按比例配制好，混合均匀后分相，上相用作固定相，下相用作流动相，分别超声脱气约20 min。

样品为苯酚、间苯二酚，各30 mg溶于5 mL上下混合溶剂中 1、主机分离管路体积的测定

用量筒取500毫升上相，用泵泵入主机管路内，当上相从管路的出柱口流出后，继续泵至上相流出30毫升，停泵，记录下量筒内剩下的上相体积，及收集到的流出上相的体积；总体积的计算：

V总=500-V剩余-V流出 (1)

式中： V总——管路测定总体积（mL）；

V剩余------泵入固定相的体积后，剩余在量筒中的体积（mL）；

V流出------流出固定相的体积（mL）。

2、固定相保留率的测定

以900 rpm的转速正向旋转已被上相充满管路的主机，同时以3.00 mL/min的流速往分离管路内泵入流动相，当主机出柱口管路流出流动相后，量出被流动相推出的上相体积（V出）；固定相保留率的计算：

保留率= ×100% (2)

式中：V总――管路总体积（mL）

V出――流动相推出上相体积（mL）

V环――进样环的体积（mL）

保留率大于等于40%为合格。

3、标准峰的验证

通过六通阀往上、下相已经平衡了的管路内加入溶解好的样品，用流动相以3.00 mL/min流速洗脱，直至标准峰的出现，整个过程须用色谱工作站记录谱图。

TBE-300A高速逆流色谱仪说明书

高速逆流色谱（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）是20世纪80年代发展起来的一种连续高效的液－液分配色谱分离技术。它利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立的一种特殊的单向性流体动力学平衡，当其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量固定相。由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，目前已广泛应用于多种领域。

HSCCC的应用领域：

1、天然产物有效成分的分离纯化;

2、多肽，蛋白质和多糖等生物大分子分离

3、抗生素的分离纯化

4、化工和化学合成物质的分离纯化

5、食品功能成分的分离纯化

6、农药残留物质分离分析

7、中药指纹图谱和质量控制研究

8、海洋生物活性成分的分离纯化

HSCCC的独特优势：

1、高效提纯；

2、大制备量；

3、低使用成本；

4、高科研价值；

5、易工艺放大；

6、高回收率。

1、系统构成：

由TBE-300A型高速逆流色谱分离仪组成的分离分析系统，一般包括：泵、主机、检测仪、恒温循环器（选购件）、数据处理系统、溶剂选择系统。如图1所示

1.1TBE-300A主机

主机是实现样品分离的场所，样品在主机内分离，并随着流动相按分配比的大小依次流出；主机包括：转速控制器、双六通阀、螺旋柱、恒温套等部分。

1.2恒流泵

以恒定的流速向主机管路内泵入固定相和流动相；使用时，应注意泵的过滤器应浸在液面以下，以防止泵入空气，影响主机的分离效果。（附：泵设定的保护压力应为2兆帕。）

1.3紫外检测仪

检测经分离后样品中各组分的吸光度，然后将吸光度转变成电信号，并传送给色谱工作站，操作详见其说明书。(附：紫外、ELSD等通用检测器都能连用。)

1.4恒温循环器

向恒温套提供温度相对恒定的传热介质，达到稳定分离场所的温度的作用。

1.5色谱工作站

将紫外检测仪传送过来的电信号，转换成数字信号，并通过相应的软件，将数字

信号记录下来。

2、主机说明