家畜布鲁氏菌病血清学平板试验(PAT)

家畜布鲁氏菌病血清学平板试验（PAT）

一、应备有下列材料：

1.受检血清：受检血清必须新鲜,无溶血现象、腐败现象、气味。

2.在实验前血清必须置于温室中，使其达到20℃左右。

3.抗原：由兽医生物药品厂生产供应。本抗原由加热杀死的布鲁氏菌菌体经染色制备而成的淡蓝色悬浮液。抗原本身出现凝集者应废弃。使用前应充分振荡，并使其温度达到20℃左右。

4.阴、阳性血清：由兽医生物药品厂生产供应，本方法所用的阴、阳性血清与试管凝集试验法相同。

二、操作方法：

1.备一方形洁净的玻璃板：划成25个方格，横数5格，纵数5格，每格四平方公分，第一列各格写下血清号码。

2.用0.2毫升灭菌吸管按下列剂量加受检血清于任何一行（横格）的各格中：第一格0.08毫升，第二格0.04毫升，第三格0.02毫升，第四格0.01毫升。（如下表）

血清号第一格第二格第三格第四格

血清量（毫升）

1 0.08 0.04 0.0

2 0.01

2 0.08 0.04 0.02 0.01

3 0.08 0.0

4 0.02 0.01

4 0.08 0.04 0.02 0.01

由于本试验所需血清量较少，因此，在操作过程中要求严格，应尽可能减少误差，最好滴出血清前用滤纸片擦去吸管表面沾附的血清。

3.加平板反应抗原原液0.03毫升于上述各血清量中，并用牙签或细铁丝混匀，使抗原和血清推开，面积直径约2—3公分的圆形。由血清量最少的一格（即第四格）混起，每份血清用一根牙签，用过的牙签要放固定容器中，工作完毕后集中烧毁。若用细铁丝作混合，每份血清混匀后应用酒精棉花擦净，然后再作另一份血清的混合。

4.混合完毕，将玻璃板置于酒精灯火焰或凝集反应箱上，均匀加温，使达到30℃左右，并轻轻摇动玻板，使血清与抗原混合液呈缓慢的旋转运动，以保证充分混合。5—8分钟内记录反应结果。

5.每次试验用1—2份已知阴性血清和1—2份阳性血清作平板凝集反应，以资对照。

6.按下列标准用加号记录反应强度

“＃”出现大的凝集片或小的颗粒物，液体完全透明，即100%凝集。“+++”有明显的凝集片，液体几乎全部透明，即75%凝集。

“++”有可见的凝集片，液体不甚透明，即50%凝集。

“+”液体混浊，有仅仅可以看出的粒状物，即25%凝集。

“—”液体均匀混浊。

7.平板凝集反应与试管凝集反应的关系：用兽医生物药品厂生产的平板抗原作平板凝集试验时，0.08毫升血清的反应相当于试管法中1：25血清稀释液的反应，0.04毫升的反应相当于1：50，0.02毫升的反应相当于1：100，0.01毫升的反应相当于1：200。

三、结果判定

在我国，牛、马和骆驼于0.02毫升的血清量，猪、山羊、绵羊和狗于0.04毫升的血清量，出现两个加号以上凝集现象时，被检血清判为阳性反应。

牛、马和骆驼于0.04毫升血清量,猪、山羊、绵羊和狗于0.08毫升的血清量，出现两个加号以上凝集现象时，被检血清判为可疑反应。

可疑反应的牲畜，经3—4周，须重新采血检验。牛和羊，如果重检时仍为可疑，可以判定为阳性，猪和马重检时，如果凝集价仍然保持可疑反应水平，而农场中的牲畜没有布病临床症状和没有大批阳性反应的患畜出现，该畜血清判定为阴性。

附：虎红平板凝集试验（RBPT）

1.虎红平板试验的特点

布鲁氏菌虎红抗原是酸性和具有缓冲作用的染色抗原，虎红平板试验能揭露猪、牛、羊、鹿布鲁氏菌病患病机体血清中的特异性IgG1亚类抗体。但也有人提出对IgG2和IgM抗体敏感性较高，椐国外资料报导，该试验与常规试管凝集反应试验相比，能较早地检出患病动物，目前为止，国内和国外的资料证明，虎红平板试验与补体结合试验结果较为接近。该试验操作简便，不需要复杂的设备，并且能迅速获得结果，适用于田间试验和筛选诊断之用。虎红平板试验判定方便，具有阳性结果的样品须进一步作补体结合试验或其它辅助试验。这样做既可节省劳力又可节省时间和得出较为正确的诊断结果。

2.在进行虎红平板试验前，应将抗原和受检血清放置室温30—60分

钟。准备一块洁净的玻璃板，用蜡笔划成四平方厘米的方格，每格中滴一份受检血清0.03毫升。吸取抗原（抗原在吸取前应反复倒转抗原瓶并摇动，使抗原均匀悬浮）。在每一方格的血清样品旁滴0.03毫升，每份血清用一根牙签搅动使血清和抗原均匀混合，使抗原和血清摊开成呈圆形直径约2—3厘米。于4分钟内判定结果。出现凝集现象就判为阳性反应，否则判为阴性。

吸取抗原和血清最好采用0.2毫升吸管，或选择每滴正好0.03毫升的毛细滴管。如果吸管数量有限,用过的吸管应至少连续通过三个盛有生理盐水的杯子冲洗。

虎红抗原应置于4—15℃冰箱中或冷暗处保存，不可结冻，从生产日期起有效期为一年。

每次试验均须设有已知阴、阳性血清对照，只有在对照血清结果成立的前提下，受检血清的检验方可认为是可靠的。

供稿人：淄博市临淄区动物疫病预防控制中心