蛋白质指纹图谱技术-标准化与重复性

-
---- Vacuum ---Accelerating Potential
7.5 5 2.5 0 6 4 2
2000
Spectra View
4730.4+H
4000
4618.2+H 2185.8+H 5045.2+H 2781.9+H 3915.2+H 2528.2+H 4000.2+H 2369.9+H3172.3+H 4345.6+H
遗传算法结合支持向量机模型（SUM）
联合学和优化方法学数据逻辑分析（LAD）策略
浙江大学肿瘤研究所： 蛋白质谱数据分子平台（ZUCI-PDAS）

相关系数： 使几个高表达的蛋白峰的强度和解析度都在 可接受范围内，以比较实验的重复性（试剂、 操作、仪器的稳定性）。
受众多因素的影响

标准化



实验条件 实验过程（样本处理、芯片结合、芯片检测） 操作 仪器和芯片 分析方法和软件 质量控制
四、重复性与标准化
生物化学芯片流程图
蛋白质芯片 抗体固定 抗体芯片 单克隆抗体
抗原捕捉
抗原抗体复合体 清 洗 结合能量吸附物质
用SELDI检测捕获的抗原
四、重复性与标准化 （一）实验条件


待测样本来源广 样品用量极少 超高的检测灵敏度，可快速获取实验结果 可用于低丰度、小分子量蛋白质的发现 可发现与疾病相关蛋白，提供疾病诊断的最佳组合指标 可进行小型实验或高通量检测自由选择
二、应用范围

生物标志物的发现

肿瘤蛋白标志物：肺癌、胃癌、食道癌、肝癌、
大肠癌、乳腺癌、卵巢癌等
PS10/PS20/RS100 特异性结合表面，以捕获生
物样品中的蛋白质
蛋白质-蛋白质相互作用
Ag-Ab、R-L作用
注：芯片表面（H4为疏水，H50为反向，NP20为亲水，Q10为强阴离子交换，CM10 为弱阳离子交换，IMAC3为固定金属亲和，PS10/ PS10为特异性结合）
Map View
6000
8000
7977.1+H
4000
6000
8000
2000
Gel View
8000
2000
4000
6000
Detector
Peptides & Proteins (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+)
（三）参数设置


疾病标志蛋白：α-Defensin 1.2.3 、LGT蛋白质
组、心血管病、糖尿病、肾移植

蛋白质的纯化与鉴定
蛋白质-蛋白质相互作用
药物研发及药理学研究
三、待解决的问题

重复性:影响蛋白标志物的确证和应用

样本收集
复杂的实验条件


操作的高度精密性
仪器和芯片的稳定性


结果偏差在解释上的混乱


激光强度 检测灵敏度 检测范围 优化范围 打击位置（20-24；80-84） 预热位置 信噪比（S/N）
（四）数据处理
■
降低基线
■
■
Normalize
均一化 不同组的多个样本比较蛋白质峰表达的 差异前必须将实验中产生的分子量和强度的 误差加以校正：
（四）软件分析

决策树判别分析模型


人工神经网络模型（ANN）


芯片的选择：CM10、Q10、H4、H50、IMAC3、 PS10/PS20/RS100 芯片列表 试剂及稳定性：国产和Sigma试剂 裂解液 HPLC纯度级或Milli Q H2O 能量吸收分子（EAM）：SPA50%、CHCA35% TFA
■
缓冲液:Binding Buffer Neutralization Buffer Washing Buffer NaAc Buffer
蛋白质指纹图谱技术 标准化与重复性
姓 名：姜 伟
专 业：检验医学信息学 导 师：王开正 教授
泸医附属医院检验医学科
一、蛋白指纹图谱技术
表面增强激光解析电离飞行时间质谱 (surface—enhanced laser desorption ／ inionation-time of flight-mass spectra， SELDI-TOF-MS) 优势指标：
结合富含丝、苏、赖氨酸的
蛋白质 结合富含精、谷氨酸的蛋白 质 结合富含赖、精、组氨酸的 蛋白质 捕获富含组、色、半胱和磷 酸化氨基酸的能与鏊合金属 (镍、铜、锌)结合的蛋白质
使用已知分子量蛋白/
多肽进行校正 分析低等电点的蛋白 寻找蛋白标志物 分析高等电点的蛋白 寻找蛋白标志物 分析与金属结合蛋白 分析磷酸化蛋白 寻找蛋白标志物
NaAc Buffer
■
实验温度:蛋白变性、芯片活化、样品与芯片 的结合（4℃ 层析柜） 孵育时间：芯片的选择
■
（二）仪器的校正

激光强度


打击的准确性
仪器的稳定性
蛋白分子量进行矫正：All-in-one芯片
insulin 芯片调教仪器解析度
Intensity
sensitivity
Y
+
方法： 混合血清

标准血清芯片
（六）质量控制

分析前的质量控制
□
样本的收集和制备
实验试剂的选择、保存、使用范围： 反应试剂 质控品 标准蛋白
□
□
实验仪器的维护与校正

实验过程中的质量控制 □ 基质效应：排除M/Z:2000以前的蛋白质峰 □ 噪音影响：去除噪音 后续数据分析的标准化 □ 分析数据性质 □ 数据分析方法的选择
HUPO：蛋白质组学数据描述系统


严格的多中心和三期临床质控验证
常用蛋白芯片特点及应用
芯片类型 特 点 应 用
H4
H 50
结合富含甘、缬、亮、异亮、
苯丙、色、酪氨酸的蛋白质 通过反相或疏水性作用与蛋 白质结合
蛋白/多肽的分析，
寻找蛋白标志物 分析疏水蛋白质 寻找蛋白标志物
NP20
SAX2（Q10） WCX2（CM10） IMAC3