法医物证课件血痕检验

检1 检2 检3 检4 A血痕 B血痕 基质
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抗A+Ac + - - +
+
-
-
抗B+Bc - + - +
-
+
-
————————————————————————— 血 型 A型 B型 O型 AB型 对 照 准 确 —————————————————————————
结果准确，无假阳性
扩增Y染色体特异性DNA片断 以Alu为对照， 男性： Alu ，特异性扩增片断 女性： Alu
AMG， ZFY/ZFX常用，结果可靠
其它检验
出血量：血量＝干血量*1000/211 总血量＝血量*倍数
出血部位：根据血液中混有的组织细胞的形 态。
鼻出血：纤毛柱状上皮细胞 口腔出血：口腔上皮细胞 肺出血：纤毛柱状上皮细胞，口腔上皮细胞
B血痕 + + + +
- - - - 准确
基质 + + + +
++++
检1 - - - -
+ + + + A型
检2 + + + +
- - - - B型
检3 - - - -
- - - - AB型
检4 + + + +
+ + + + O型
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4、特点
方法稳定，结果可靠。 检材用量大，适于检材量不受限制的案件。
凝集原的稳定性远强于凝集素，检出时限 可达数十年。
常用方法： 吸收试验 解离试验 混合凝集试验
一）吸收试验
1.原理：血痕中的A、B、H血型物质，能与相应 的抗－A，抗－B，抗－O抗体发生特异性结合， 使抗血清中的游离抗体减少或消失，不能再 与相应的A，B，O型指示红细胞发生凝集反应。 若血痕中无某种ABH抗原，则不能抑制抗血清 中的相应抗体，抗体与相应的指示红细胞会 发生凝集反应，其反应强度没有变化。根据 抗血清与血痕吸收反应前后的效价的变化情 况，判断血痕的ABO血型。
性别DNA分析技术
1. 牙釉基因（amelogenin,AMG）
AMG: Xp22，编码牙原基牙釉质蛋白。 AMGL: Y染色体中心粒附近，与AMG有90％同 源性。 一对特异性引物。 男性：977bp, 788bp 女性： 977bp 扩增产物长，不适合陈旧腐败检材
2. ZFY/ZFX基因
ZFY: Y染色体，编码一种锌指状蛋白。 ZFX: X染色体，与ZFY有同源序列。 三条引物。 男性：340bp, 488bp 女性： 488bp
＋ ＋ — ＋ — ＋ ＋ ＋ O1A2 Ａ２
O2+ — + + — — + — + O2 O2 Ｏ
—＋ —＋ —＋
+ ＋ + — — ＋ O2 B Ｂ
+ ＋ — ＋ — ＋ O2Ａ1 Ａ１
+ ＋ — ＋ + ＋ O2 A2 Ａ２
ABO血型的PCR-SSP分型结果
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反应结果 O1 non O1 O2 nonO2 B nonB A2 nonA2 基因型 表现型
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B+
— ＋ — ＋ + — — ＋ BB Ｂ
— ＋ — ＋ + + — ＋ A1 B — ＋ — ＋ + + + ＋ A2 B
A1Ｂ A2Ｂ
A2 +
— ＋ — ＋ — + + ＋ A2 A1 A1
解离试验原理示意图
抗A+Ac 抗B+Bc
吸附 4℃
洗涤
解离 56℃
凝集
2、方法
取材固定 甲醇、乙醚，10′挥干
吸附 4 ℃ ，60—120 ′
洗涤 4℃，生理盐水 0.1—0.2％ 指示红细胞
解离 50—60℃，5—10 ′
凝集
1)试管法
1、取材固定：血痕纤维0.5cm, 甲醇、乙醚，10分钟，挥干
吸附： 室温30－60分钟，或4℃， 60－120分钟
抗A
抗B
• 洗涤
4 ℃，生理盐水
抗A
抗B
• 解离 ：加0.1指示红细胞， 50—60 ℃，5—10 ′
抗A
抗B
结果:显微镜下观察凝集情况，并判定血型。
抗A+Ac
+
血型：A型。
抗B+Bc
-
3、结果及血型判定
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5、注意事项；
1）抗血清效价：16-32×，如检材陈旧，或量 较少时，可用8－16×
2）浸泡检材：4℃12-24hr。 3）指示红细胞：吸收前后，测定抗血清校价
的指示红细胞要一致，浓度1－2％。视抗血 清效价而定。 4）对照：阴性：无血痕检材基质，
阳性：已知A,B血痕。
二）解离试验
1、原理：血痕中的A、B、H血型物质，能与 相应的抗－A，抗－B，抗－O抗体发生特异 性结合，这种特异性结合是可逆的，56℃ 加热后，血痕上抗原结合的抗体可以解离 下来，用已知的A，B，O型指示红细胞检测 解离液中的抗体。红细胞发生凝集者为解 离试验阳性。红细胞不发生凝集者为解离 试验阴性。综合反应结果，判断血痕的ABO 血型。
抗A
抗B
血痕
已知抗体 பைடு நூலகம்示红细胞
吸收试验原理示意图 >A
>B
血痕
红细胞 凝集
血清抗 体
2、方法：
血痕纤维1× 0.5㎡ 剪碎，置试管内 加32×抗A三滴，4℃ ，12—24小时 取上清液，用1—2% Ac测定其效价 效价降低（吸收）三级以上为阳性。
同法做抗B的吸收。
根据抗A、抗B的吸收情况，推测检材含有 的凝集原，从而判定血型。
第五节 血痕的个人识别 personal identification
通过对血痕遗传标记的检测， 从而确定血痕是否来源于某个特定 个体。
用于血痕个人识别的遗传标记
红细胞血型：ABO，MN
血清型； Hp，GC，Tf
酶型：
EAP，EsD，PGM1
HLA
DNA
一、ABO血型测定
1、天然抗体： 效价高，特异性好。 检测方法简单稳定。
反应结果 O1 non O1 O2 nonO2 B nonB A2 nonA2 基因型 表现型
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O1+
+ — — + — + — ＋ O1 O1 Ｏ
＋ ＋ ＋ ＋ — ＋ — ＋ O1 O2 Ｏ
＋ ＋ — ＋ ＋ ＋ — ＋ O1 B Ｂ
＋ ＋ — ＋ — ＋ — ＋ O1Ａ1 Ａ１
1、原理；
抗A+Ac 抗B+Bc
吸附
洗涤
红细胞粘连
2、方法： 固定
甲醇、乙醚，10′挥干
吸附 4℃ ，60—120 ′
洗涤 4 ℃，生理盐水
镜下观察 0.2％指示红细胞1滴, 30′
3、结果：
抗A+A红细胞 血型：A型
抗 B+ B红细胞
3、血型判定；（同解离试验）
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原理： Ag+Ab—E
Ag—Ab—E
S(显色反应）
ABO基因型PCR-RFLP分析谱型
1
200bp
2
171bp
3
159bp
4
1
2
3
AB OO BB
4
5
BO AA
2号带（171bp）为O 片段， 4号带（118bp）为B片段
118bp
6 AO
ABO血型的PCR-SSP分型结果
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2、吸附：室温或4℃， 60－120分钟
抗A
抗B
3、 洗涤 4 ℃，生理盐水洗去多余的抗体 4、 解离 加0.1%指示红细胞，
50—60℃，5—10 ′
抗A+Ac
抗B+Bc
5、结果: 将指示红细胞倒在玻片上，
观察凝集情况，并判定血型。
抗A +Ac
+
血型：A型。
抗B+Bc
-
2）玻片法：
固定： 2％的蛋清黏附检材，甲醇、乙醚，10’ 挥干
已知A型、B型血痕及无血基质作对照。
3、结果及血型判定
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抗A+Ac
抗B+Bc
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1/2 1/4 1/8 1/16 1/2 1/4 1/8 1/16 血型
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A血痕 - - - -
+ + + + 对照
EAP, EsD, PGM, G6PD,GLOⅠ
四、血痕的DNA分析
当前血痕分析的常规技术 关键步骤：DNA提取 常用的DNA提取方法:
有机溶剂法：纯度高，得率低。 chelex法：纯度低，得率高。 常用的DNA分析技术：STR, HLA-DQ,mtDNA
五、血痕的性别鉴定
X,Y性别染色体形态鉴定 性激素 DNA分析：扩增性染色体上的特异性片断。
— ＋ — ＋ — + + — A2 A2 A2
Non+ — ＋ — ＋ — + — ＋ A1 A1 A1
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二、血痕的血清型测定
常用的血清型：Hp, Gc, Gm, Km, Tf等
检测方法：与血清相似。 1.检材的处理： Hp 以氯仿抽提去除血红蛋白 1cm2检材＋25％蔗糖 2-3min 0.3ml氯仿，离心
检1 检2 检3 检4 A血痕 B血痕 基质
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抗A+Ac + - - +
+
-
-
抗B+Bc - + - +
-
+
-
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血 型 A型 B型 O型 AB型 对 照 准 确
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阳性：已知A,B血痕。
三）混合凝集试验 （红细胞粘连试验）
1.原理：抗A，抗B抗体多为IgM, 其分子上有多个 抗原结合位点，血痕与足量的抗体反应后，抗体 结合到血痕相应的抗原上，形成Ag－Ab复合物， 但抗体的抗原结合部位未被占满，还可以与指示 红细胞发生抗原抗体反应，形成Ag－Ab－指示红 细胞复合物。指示红细胞黏附于血痕上位阳性反 应，不黏附为阴性反应。
2、抗原分布广泛： 红细胞，体液（唾液、精斑） 其他组织细胞（肌肉，毛发，骨骼）
3、抗原稳定： 检出时限长，数月、数年、数十年。
2、方法： 检材纤维0.5 X 0.5cm²
置载玻片上，稍加分离，
已知0.2％ Ac一滴
室温15—30ˊ
凝集为阳性，检材含有
显微镜下观察
A凝集素
不凝集为阴性，
同法做B凝集素的检测。 根据检材所有凝集素的情况，判定检材的 血型。 已知A型、B型血痕及无血痕基质做对照。
出血时间:
小结
本节主要解决血痕是谁的问题（个人识 别）。要通过对血痕遗传标记（血型）的 检测来完成。
可用于血痕个人识别的遗传标记：红细胞 血型，血清型，酶型，DNA等。
本节主要介绍了血痕的ABO血型测定方法： 吸收试验；解离试验；混合凝集试验 （红 细胞粘连试验）
小结
吸收试验；方法可靠，捡材用量大。 解离试验；灵敏，适于微量捡材。 混合凝集试验：与解离试验类似，更适于
3、结果及血型判定；
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检1 检2 检3 检4 A血痕 B血痕
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Ac + - + -
-
+
Bc - + + -
+
-
—————————————————————
凝集素 A B A、B -
B
A
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4、特点：
灵敏，适于微量检材； 抗血清效价要求高，>64。 重复性较吸收试验差，操作要求精细。
5、注意事项：
1）抗血清效价要高： > 64x 2）指示红细胞浓度要低：0.1—0.2%，新鲜。 3）关键步骤是洗涤；洗涤不足——假阳性
洗涤过分——假阴性 4）注意O型血的判定：应做抗H。 5）对照：阴性：无血痕检材基质，
血 型 B A O AB 对照准确
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4、注意事项： 1）凝集素蛋白稳定性差，检出时限短，约1周 2）指示红细胞浓度0.2％ ，新鲜。 3）红细胞凝集通常位于血痕外周。 4）凝集原测定的补充和参照。
二）凝集原测定
凝集原（血型物质）测定是血痕ABO血型 测定的主要途径。
涂片，组织切片的血腥测定。 其他血型的测定与新鲜血液的血型测定类
似。
4、特点：
与解离试验类似适于微量检材 尤其适于组织切片、细胞涂片等。
A型精子
B型上皮细胞
四)、其他检测方法:
1.胶乳颗粒凝集试验： 胶乳颗粒+Ab Ab－胶乳颗粒
2.抗体标记法： 同位素标记 酶标记法（ELISA）
3、DNA分型方法
PCR-RFLP PCR-SSP
酶联免疫吸附实验（ELISA)
2. 多采用电泳+免疫固定， 或电泳+免疫固定+ELISA
3、判型
三、血痕的红细胞酶型
酶蛋白在血痕中的改变 1.酶的活性改变，不可逆。 2.酶的结构改变：残基脱落，负电荷增加， 谱带数量、位置改变。 3.形成可逆的二硫化物，可用还原剂使酶蛋 白复原。
检测方法
电泳＋酶活性显色
血痕检测常用的酶型