小鼠腹腔巨噬细胞准备

peritoneal macrophage cell preparation
1.小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡3分钟，取出小鼠，置于无菌纸上，腹面朝上；
2.用镊子提起小鼠下腹部皮肤，剪开一小口，撕开皮肤，完全暴露腹膜；
3. 10ml注射器装上大号针头，注入6 ml Hanks液或PBS，用镊子提起腹膜，向腹腔中注入Hanks液，针尖朝上，避开肠和脂肪，回抽腹腔液，不同方向冲洗数次，吸出腹腔液；
4.细胞悬液离心200×g10分钟，用Hanks液洗一次，用RPMI1640－5%小牛血清悬起细胞，2×106细胞/ ml.
5.细胞悬液置入培养瓶，37度培养2小时后，吸弃上清，用预热培养基洗二次，留下贴壁细胞；
6.含10 mM EDTA的PBS加入培养瓶，覆盖细胞，37度孵育20分钟，用吸管用力吹打下细胞，或用橡皮擦帚轻轻刮下细胞，即为腹腔巨噬细胞，纯度一般大于90%，每只小鼠平均可得2×106腹腔巨噬细胞。

注:
1.雌性小鼠6-8周最适用。

雄性小鼠肠壁脂肪多。

不利于腹腔液收集；
2.在冲洗过程中应小心，以免刺破血管或肠壁，血液流入腹腔液；
3.吸出的腹腔液应洗后再贴壁，否则有血浆膜形成，影响贴壁；
4.贴壁巨噬细胞分离有较多方法，如利多卡因孵育，但大多不理想，故细胞分离后应用台盼兰染色检测活力；
5.橡皮擦帚可自制，用自行车气门芯上的橡皮管套在预先折弯的滴管尖头上，灭菌后使用，较为实用；
6.炎性巨噬细胞的制备可用3%的脱水硫羟乙酸培养基2ml，注入小鼠腹腔，4天后同法集腹腔细胞，每只小鼠腹腔细胞产量可以增加到3×107细胞左右。

需指出的是炎性巨噬细胞的功能活性与正常腹腔巨噬细胞有很大差异。

小鼠腹腔巨噬细胞提取的经验方法总结如下：
第一：
用刺激物质的方法，一般都是在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠（应该现配现用，否则效果较差）每只2ML。

实验当天将小鼠断头处死，置于1%的新洁尔灭或者75%的乙醇溶液中浸泡2—3MIN，消毒皮肤。

于无菌环境下向腹腔注入HANKS液8ML，用手轻轻挤压腹壁20次以上，吸出灌洗液。

将灌洗液离心2000R/MIN，5MIN，弃去上清，用HANKS洗涤3次，合并小鼠细胞，用含15%小牛血清的RPMI1640培养液重悬细胞，记数，调整腹腔细胞浓度为
2*10*6/ML，将腹腔细胞加入24孔培养板中，1ML/孔，于37摄氏度，5%CO2培养箱中培养3–4小时，使巨噬细胞贴壁，取出培养板，弃去上清夜，用HANKS也反复吹洗培养孔3遍，除去非粘附细胞，即为巨噬细胞单层.（炎性巨噬细胞，即激活的巨噬细胞）
第二种：
不加刺激物质的提取方法：
1实验结束后，拉颈处死小鼠，用75%酒精消毒。

2用带9号针头的5ML注射器腹腔注入含75%小牛血清的HANKS液
（5%NBS—HBSS）轻柔腹部吸出腹腔液体（内含腹腔细胞0，反复抽吸几次。

3 1500 R/MIN离心8MIN，用5%NBS—HBSS洗2次。

4将腹腔细胞用含10%小牛血清1640液（10%NBS—1640）配成2*10#6/ML 加到24孔平底培养板中，1ML/孔，5% CO2温箱孵育2H
5每孔用5%NBS—HBSS洗3次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为巨噬细胞单层
6要注射，可用6%淀粉肉汤注射，每次1ml,连续注射两天，第三天即可提取。

7用FACS鉴定细胞纯度为70%左右，重复9次，稳定
见《免疫学常用实验方法》应该是这一本书，2001出版的
自己作这个实验时，考虑了方方面面的问题。

1.因为要求无菌操作，所以取腹腔细胞的时候，尽量在无菌造作台上进行。

无菌操作台事先要消毒。

2.为避免交叉感染，每一只小鼠我只用一个针头，为了节约我只买了4个注射器，只换针头即可！！
3.事先我也想到了，如果有的小鼠即便注射了5%小牛血清HANKS，在抽取的时候也未必能抽出液体，因此事先准备了开腹的手术器材；刀子，镊子等，事先一定要高温消毒。

正式实验时，有的小鼠真的没有取出液体，然后我就开腹腔了。

这一步一定要注意操作，要有无菌意识。

鉴定：
Macrophages were indentified by the following features:
i) adherence to culture plates;
ii) morphological features resembling monuclear cells after Giemsa staing;
iii) the capacity to take up carbon particles;
ii) positive immunohistochemistry with antibady for CD68
1腹腔分离出的细胞有两种：
大的巨嗜细胞和小红细胞。

如果腹膜剪开能不损伤大血管的话，红细胞很少，离心后可以看到白白的沉淀，否则有红色沉淀。

不过培养贴壁后，红细胞可以洗下来；或者3天后死亡。

对实验无影响。

也就是说不需要特意鉴定。

2刚分离的巨噬细胞没有变形，但是随着培养时间的延长，可以看到它们逐渐变成多角形，体积比其他细胞大一些，具有贴壁的特征，胞质有明显的颗粒状物质。

3当然进一步的验证可以用瑞氏染液和姬姆萨染液来检验。

4表面标志可以鉴定巨噬细胞的纯度
ED1（CD68）大多数组织巨噬细胞上表达;
ED2（CD163）主要表达于50％腹膜巨噬细胞、部分脾巨噬细胞和其他多数组织的巨噬细胞.5可以找Mac387,KP1,CD116，CD64，CD32等巨噬细胞独特的荧光标记抗体流式细胞仪鉴定!消化：
试试速冷至2℃，然后猛摇，可脱落！
也可加入不含防腐剂的利多卡因(250mmol/L)。