液相色谱质谱分析

流动相过滤与脱气装置 ➢ 流动相过滤装置
分为在线过滤和真空过滤 ➢ 流动相脱气装置
分为在线真空脱气和超声波脱气
(2) 高压输液泵 泵体材料耐腐蚀
能在高压下连续 工作,耐压4050MPa. cm2
高压输液泵
输出流量稳定， 重复性高,输出 流量范围宽
泵腔的体积要小， 以便快速更换 溶剂
压力平稳，无 脉冲
4、进样时，手柄处于Load和Inject之间时，应尽快转阀，不 能停留在中途。
5、每次结束后应反复冲洗进样器再用无纤维纸擦净注射器针 头的外侧。
(3) 分离系统 色谱柱
柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～ 40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
色谱柱的使用和维护
1．使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有 一定的溶解度)。
液相色谱质谱分析
主要内容
一、 液相色谱概述
二、 HPLC仪器构成
三、高效液相色谱法的类型及分离机理 四、色谱分离方法的选择 五、质谱仪
一、 概 述
1 、高效液相色谱
高效液相色谱（HPLC）是一种以液体为流
动相的快速分离分析色谱技术。具有高压、高速、 高效、高灵敏度的特点，对于那些沸点高，热稳 定性差，相对分子质量大的有机化合物如烷烃、 烯烃、芳烃、染料、蛋白质、氨基酸、核酸等均 可进行分离分析。
a. 紫外检测器 b. 光电二极管阵列检测器 c. 示差折光检测器 d. 荧光检测器 e. 电导检测器 f. 质谱检测器
a. 紫外检测器
应用最广，对大部分有机 化合物有响应。 特点：
灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm ×10mm，容积 8μL）； 对流动相的流速和温度变 化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。
(2) 进样系统 进样针
六通阀
六通阀进样 装置
准备状态
进样状态
六通阀进样 装置的使用及保养
1、进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样品 溶液均要用0．45微米的滤膜过滤。
2、进样时，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，以免漏液和引 入空气；另外，也防止了针头刺坏密封组件及定子。
3、进样时，要求完全置换样品定量环内残留的溶液，以此提 高精密度及重现性。
一些常用溶剂的紫外截止波长
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溶剂
CS2 氯仿 四氢 苯 乙腈 甲醇 水 呋喃
紫外截 380 245 212 210 190 205 187 止波长
/nm
三、高效液相色谱法的类型及分离机理
类型
吸附色谱 分配色谱 凝胶色谱 离子交换色谱 离子排斥色谱 离子对色谱 疏水作用色谱 手性色谱 亲和色谱
主要分离机理
b. 光电二极管阵列检测器
紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
254 nm
两种检测器的色谱图 (a)：可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器
紫外检测器灵敏度高，精密度及线性范围较好 ， 可用于梯度洗脱。 流动相选择有限制。
高效液相色谱的优点
3）气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产 生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用 不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参 与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用， 相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离 条件提供了极大方便。
二、 HPLC仪器构成
2 、 HPLC仪器组成： • 高压输液装置 →进样系统 →分离系统→
检测系统
高压输液系统
(1) 贮液器
用来供给足够数量的合乎要求的流动相以完成分析 工作。
➢材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮 （PEEK） ➢ 容积：0.5～2.0L ➢ 放置位置：高于泵体，保持一定的输液静压差 ➢ 注意：密封、过滤
高效液相色谱的优点
1）高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、 高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快 数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色 谱配备了高压输液设备，流速最高可达 10cm3·min-1. 2）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们 仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、 热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进 行分离和分析。
主要分析对象或应用领域
吸附能，氢键
异构体分离、族分离，制备
疏水分配作用
各种有机化合物的分离、分析与制备
溶质分子大小
高分子分离，分子量及其分布的测定
库仑力
无机离子、有机离子分析
Donnan膜平衡
有机酸、氨基酸、醇、醛分析
疏水分配作用
离子性物质分析
疏水分配作用
蛋白质分离与纯化
立体效应
手性异构体分离，药物纯化
梯度淋洗装置
(内梯度)
梯度淋洗装置
(外梯度)
等度洗脱与梯度洗脱
梯度洗脱 的特点
改善分离, 加快分析速度； 改善峰形, 减少拖尾; 可能引起基线漂移
分配比变化范围宽的 复杂样品应采取 梯度洗脱方式分离
流动相溶剂选 择的一般要求
1) 对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。 2) 适用于所选择的检测器。 3) 化学惰性好，以免破坏固定相。 4) 低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。 5) 纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。
2．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱 柱的pH范围。
3．避免流动相组成及极性的剧烈变化。 4．流动相使用前必须经脱气和过滤处理。 5．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱
子冲洗干净，并保存大乙腈中。 6．压力升高是需要更换预柱的信号。
(4) 液相色谱检测器
生化特异亲和力 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
2. 分配色谱（液－液分配色谱）
4）气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常 可在室温条件下工作。
2 、液相色谱仪器
（high performance liquid chromatograph）
液相色谱仪（1）
液相色谱仪（2）
液相色谱仪（3）
液相色谱仪（4）
LCQ Deca XP MAX液相色谱质谱联用仪
1 、流程