第十章 重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选

第二节
转化子的筛选与鉴定
一、利用遗传标志的表型特征筛选 二、根据重组子的结构特征筛选
一、利用遗传标志的表型特征筛选
㈠ 由载体提供的性状进行筛选
– 1. 抗菌素抗性标记筛选 – 2. 抗性基因的插入失活筛选 – 3. β-半乳糖苷酶（LacZ）基因失活筛选 法及其α互补的原理
㈡ 根据插入基因的遗传性状进行筛选
全自动DNA测序仪 末端终止法，采用4种荧光染料标记ddNTP， 在同一泳道测序，为人类基因组测序做 出重大贡献。
二、目的基因测序方法
• ㈠ 酶法 酶法——双脱氧链的末端终止法 双脱氧链的末端终止法 • ㈡ 化学（裂解）法 化学（裂解）
酶法——双脱氧链的末端终止法 双脱氧链的末端终止法 酶法
1. Sanger双脱氧末端终止法：因掺入dd-NTP的链 不能再延长而形成不同长度的末端为A、G、 C、T的片段。图5-5 2. Sanger双脱氧-M13体系测序法：采用M13噬菌 体组装基因后，再由引物合成不同长度末端 为A、G、C、T的片段 图5-6 3 .Sanger双脱氧-PUC体系测序法：类似M13体系， 只是由PUC体系替代M13噬菌体，再由引物 合成不同长度末端为A、G、C、T的片段。 图5-7
重组DNA导入宿主细 重组DNA导入宿主细 DNA 胞与转化子的筛选? 胞与转化子的筛选?
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重组DNA向宿主细胞的导入 转化子的筛选与鉴定 目的基因序列测定
第一节
重组DNA向宿主细 胞的导入
一、转化 二、通过接合作用传递质粒DNA 三、通过转染/转导作用传递遗传物质
（1）感受态细菌的制备 接种一环DH5α于2ml LB中 37℃，振荡过夜 以约1%的接种量接入20ml LB中 振荡培养约90’至OD600≈0.2 90’ OD 离心（5K，5’） 5K 5’ 收集菌体 加入预冷CaCl2（10 ml 100mM） 冰浴20’ 离心 收集菌体 加入 100ul100mM预冷CaCl2 混匀
一、转化 : 以质粒作为克隆载体将目的基因导 入宿主细胞 1928年, 美国的Oswald, Avery 首次开展了肺炎球 菌的转化试验 感受态细菌是指细菌处于容易接受外源 DNA的状态。有的细菌在生长周期任何时候自 动产生如枯草、嗜血杆菌。有的在对数生长期 发生，如E.coli。产生机制不明。一是原生质体 假说，另一是酶受体假说。 转化作用就是一种基因型细胞（感受态细 菌）从周围介质中吸收来自另一种基因型细胞 的DNA, 进而使原来细胞的遗传基因和遗传性 发生相应变化的现象。常见转化方法有㈠ 原生 质体转化法； 化学转化法； 质体转化法； ㈡ 化学转化法； ㈢电穿孔法。
二、通过接合作用传递质粒DNA
F质粒（F因子）又称性质粒, 除了含有自我复 制基因外, 还带有一套接合转移的基因, 凡携有F质 粒的细菌称F+菌株。不带有F质粒的细菌称F－菌株。 F+菌株（供体菌）一旦与F－菌株（受体菌）发生接 触，F+菌株可通过性菌毛将F质粒转给F－菌株，使F － 菌株转变成 F+菌株。质粒由F+向F－菌的转移过程 叫接合作用传递质粒, 又称质粒的接合传递。凡带有 在染色体上整合F质粒的细菌又称高频重组株系 （Hfr株系）。Hfr株系不稳定，F质粒可发生接合传 递质粒DNA, F+菌株可失去F质粒, F－菌也可获得F质 粒, 其转移难以人为控制,又不稳定， 通常不用作克 隆载体。
酶的底物) 酶的底物 X-gal (酶的底物
非重组质粒: 不含有插入的 DNA蓝色菌落 重组质粒: 含有插入的 DNA: 白色菌落
非重组质粒
重组质粒
back
α-互补的原理
所谓基因内互补作用，在LacZ体系中,是指二个彼此互补的突 变基因（突变体1缺失LacZ近操作基因区段LacI；突变体2 带有完整的近操纵基因而无β-半乳糖苷酶活性），它们编 码产生的无活性的多肽产物，但由于二个突变体之间通过α 肽互补作用可呈现有功能的β-半乳糖苷酶活性, 进而可分解 底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）而产生半乳糖 和深蓝色的底物5-溴-4-氯-青定蓝, 使菌落呈现出蓝色反应。 然而，当外源基因DNA片段插入载体中LacZ α肽区段的多 克隆位点后, 就会阻断α序列的读码结构, 使其编码的α肽失 去活性, 使重组子所在的细菌不能完成α-互补, 因此带有外 源基因重组子的细菌形成白色菌落。根据这种β-半乳糖苷 酶的显色反应，可以检测和筛选出携有外源基因重组子克 隆。此法又称蓝白筛选法。如图5-1
原生质体转化法:除去细胞壁后加外源DNA，经 ㈠ 原生质体转化法 吸收恢复再生培养，如枯草杆菌。 。 化学转化法: ㈡ 化学转化法 1970年Mandel和Higa首先用CaCl2 经短暂的热休克后，可使外源DNA转入E.coli。 1.原理：将对数生长期的细菌在0℃下, 用预冷的 CaCl2溶液低渗处理, 以使菌体的细胞壁和细胞膜 通透性增加, 菌体膨胀成球形。DNA易于进入细 菌的细胞内 。 用冷CaCl2低渗处理E.coli使菌体成球形， 外源DNA被吸附，经短暂42℃热休克，易于进入 胞内而不被降解，转化效率达105-106，它与菌株 （hsdR-). 2.方法 : （1）感受态细菌的制备 （2）转化
接合---- F+×F－
Donor
F+
F-
F+
F-
Recipient
F+
F+
F+
F+
三、通过转染/转导作用传递遗传物质
㈠ 转染 病毒（含噬菌体）DNA及其重组子DNA导入宿主细 胞（或细菌）的过程称转染。 ㈡ 转导 以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程称转 导。 原理：1.重组外源基因的噬菌体DNA, 体外包装成噬菌 体，感染宿主菌，同时导入外源基因。 2.噬菌体的主动感染将含有外源DNA片段的重 组噬菌体DNA导入宿主菌体内
（2）转化： 0℃，在1.5ml离心管中按下表加入
CaCl2、受体菌及DNA进行转化实验
转化项目 a阳性对照 b阴性对照① c阴性对照② d连接液转化组 CaCl2 —— 10ul —— —— 受体菌 10ul —— 10ul 60ul DNA
PBR322DNAlng
液体LB 100ul 100ul 100ul 600ul
同尾酶BamHI和BglII
…AGATCT… …GGATCC… …TCTAGA… …CCTAGG… BglⅡ BamHI …A GATCC… …TCTAG T4连接酶 G… AGATCC… TCTAGG…
肺炎双球菌转化实验
第三节
目的基因序列测定
一、目的基因序列测定的意义
美国联邦国家人类基因组研究项 目负责人弗朗西斯·柯林斯博士在华盛顿 隆重宣布，人类基因组序列图绘制成功， 人类基因组计划的所有目标全部实现。由 美、英、日、法、德和中国科学家经过13 年努力共同绘制完成了人类基因组序列图， 在人类揭示生命奥秘、认识自我的漫漫长 路上又迈出了重要的一步。
二、根据重组子的结构特征筛选
– 1. 重组子大小鉴别筛选 菌落——提取质粒 ——单酶切——电泳 原质粒 – 2. 酶切鉴定 菌落——提取质粒 ——双酶切——电泳 原质粒 – 3. PCR筛选法 能与插入基因片断两端互补的特异引物, 以 少量抽提的重组子 DNA为模板, 进行PCR分析
– 4. 原位杂交 图5-3、5-4 该法是从基因组文库中筛选目的基因的首选方法。 – 5. 斑点杂交 1)重组体DNA或RNA抽提出来, 麻烦 2)抽提纯化, 蛋白质、 杂DNA等减少, 所以能得到 更为确切的结果, 既可用于定性,对拷贝数进行相 对定量。 – 6. Southern blot杂交法 原位杂交与斑点杂交都只能鉴定整个重组子中是 否会有与探针互补的同源片段, 而Southern blot杂 交能将同源片断定位于基因
亮氨酸（Leu)缺陷菌在无Leu培养基中不生长， 当含 Leu外源基因在此缺陷菌中表达时可生长，以此来筛选 阳性克隆。
Ampr pBR322 ori
Tcr B
B
X
B
Ampr
B X B
Ampr
Tcr
ori Ampicillin 抗性?
ori
yes No
yes yes
Tetracycline 抗性?
transfer of colonies
皿
2ul连接液 —— 6ul连接液
冰浴30’
42℃ 2’（热休克）百度文库
冰浴，2’
加37℃预热LB培养45’ 表中a、b、c各取100ul/皿 涂 布 （ 连 接 液 转 化 组 d 梯 度 涂 布 I 50ul×2 皿 ； II.500ul浓缩后×2皿） 37℃倒置培养过夜 检查细菌生长情况
㈢电穿孔法 原理：利用高压脉冲电场, 在宿主细胞表面 形成暂时性的微孔, 质粒DNA可乘隙而入, 在脉冲过后, 微孔复原 。 它比CaCl2法操作更简单，转化效率高 （一般可达109～1010个转化子／µg DNA）, 不仅无需制备感受态细胞, 而且 适用于任何菌株。
+ampicillin
+ ampicillin + tetracycline
这些克隆是有重组质粒的细菌
back
编码β-半乳糖苷酶 编码
lac promoter↑ IPTG 蓝色菌落 IPTG可诱导lacZ形成α肽链,该产物能与有缺陷的宿主 细胞所编码的N-末端发生基因内互补，形成有活性的 β-半乳糖苷酶，分解底物X-gal使菌落呈现蓝色。 当外源基因DNA片段插入多克隆位点后, 使其编码的α 肽链失去活性, 使其不能形成α-互补, 因此带有外源基 因重组子的细菌形成白色菌落。
①双脱氧－M13体系DNA序列分析法
M13含单链DNA，在细菌内形成双链环状DNA （RF）。成熟的噬菌体含单链DNA分泌到培 养液中。 双链DNA（RF）：克隆载体，按提取质粒方法 从细菌中制备 单链DNA：测序模板，从培养基的上清中提取
目前常用的M13mp18 图5-6
• ㈡ 化学（裂解）法 化学（裂解） 在无NaCl下，用联氨（肼）可打开C、T碱 基，在C、T碱基发生断裂，形成T+C组。加 入NaCl，肼切割C形成C组。在中性条件下， 硫酸二甲酯可在G处断开形成G组。加入甲 酸可在A、G处断开，形成G+A组，最后电 泳经感光读片，自动分析得到测序结果。如、 图5-9 5-10