时间分辨荧光免疫分析技术及临床应用

时间分辨荧光免疫分析技术及临床应用

武学成1,2(综述),何　林1,周克元2(审校)

(1.深圳人民医院检验医学部,广东深圳518001;2.广东医学院,广东湛江524001)

中图分类号:R44616 文献标识码:A 文章编号:100622084(2006)0720434203

摘要:标记免疫分析技术的出现使临床生化分析由常量分析向微量分析转变。20世纪80年代出现的时间分辨荧光免疫分析技术,以其独特的优势成为最有发展前途的非放射免疫标记技术。本文主要介绍时间分辨荧光免疫技术基本原理、基础试剂、基本技术以及近年来临床应用。

关键词:时间分辨荧光免疫分析技术;铕;标记技术

The R esearch and C linical Application of Time2resolved F luoroimmunoassay　WU Xue2cheng1,2,HE Lin1, ZHOU K e2yuan2.(1.The Medical Laboratory Department o f Shenzhen People′s Hospital,Shenzhen518001,China;

2.Guangdong Medical College,Zhanjiang524001,China)

Abstract:The marked immunoassay technique gives the changes from macroanalysis to microanalysis.T ime2 res olved fluoroimmunoassay technology is a non2radio2immunity labeling technique having m ost perspective future because of its unique advantage since1980s.This article reviewed s ome aspects about it including fundamental principle,basic reagent,basic technique and the its clinical application in recent years.

K ey w ords:T ime2res olved fluoroimmunoassay;Europium;Labeling technique

随着生物标记技术的不断进步,免疫分析技术得到了长

足的发展。免疫分析技术逐步由放射免疫分析技术向非放射

免疫技术转变。在此期间,涌现了一大批非放射免疫技术,例

如酶免分析技术、化学发光免疫分析技术、时间分辨荧光免疫

分析技术(time2res olved fluoreimmuoassay,TRFI A)等。但是从灵

敏度来说只有时间分辨荧光免疫分析技术可与放射免疫媲

美。TRFI A是20世纪80年代迅速发展起来的的一种公认的

最有发展前途的非放射免疫标记技术。

1　时间分辨荧光免疫分析技术的基本原理

TRFI A是用镧系金属离子作为示踪物标记蛋白质、多肽、

激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞,与其螯合剂、增强液

(有一部分不需要)在待反应体系(如:抗原抗体免疫反应、生

物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀

伤反应等)发生反应后,用时间分辨荧光仪测定最后产物中的

荧光强度,根据荧光强度和相对荧光强度比值,推测反应体系

中分析物的浓度,达到定量分析的目的。

2　时间分辨荧光分析技术简介

TRFI A的基础试剂包括示踪剂、稀有元素双功能螯合剂、

分析缓冲液、增强溶液。基本技术包括包被技术、标记技术、

反应模式。

2.1　基础试剂

2.1.1　示踪剂的选择和使用　所使用的稀土元素主要位于

元素周期表中的ⅢB族,包括钪(scandium,SC)、钇(yttrium,Y)

和镧系元素。到目前为止,只有铕(europium,Eu)、铽(terbium,

Tb)、钐(samarium,Sm)、钕(neodymium,Nd)、镝(dysprosium,Dy)

等5种被用作TRFI A示踪剂,尤以Eu3+常用。一般用Eu2O3

制备成EuCl

3

,再经纯化和常温真空抽干,然后干燥保存。用

Eu3+等镧系元素作为示踪剂有以下特点:①荧光物质激发光

谱曲线的最大吸收波长和发射光谱的最大发射波长之间的

差,称为S tokes位移。普通荧光物质荧光光谱的S tokes位移

只有几十纳米,激发光谱和发射光谱通常有部分重叠,互相干

扰严重。游离铕的荧光信号虽然相当微弱,但当Eu3+与螯合剂形成螯合物时,产生分子内和分子间能量传递,使Eu3+的荧光强度显著增强,S tokes位移达200nm,很容易分辨激发光和发射光,从而排除激发光干扰;②镧系元素与普通的荧光团比较,镧系元素离子螯合物荧光的衰变时间(decay time)长,为传统荧光的103～106倍。稀土离子及一些常见荧光物质的荧光寿命(见表1)。镧系元素的荧光不仅强度高,而

且半衰期也很长,介于10～1000μs之间。这样,用时间分辨荧光仪测量Eu3+螯合物的荧光时,在脉冲光源激发之后,可以适当的延迟一段时间,待血清、容器、样品管和其他成分的短半衰期荧光衰变后再测量,这时就只存Eu3+标记物的特异性荧光,即通过时间分辨,极大地降低了本底荧光,实现了高信噪比,这是TRFI A高灵敏度和低干扰的原因之一。如果在使用链霉亲合素2生物素系统,可更好地降低非特异性荧光的干扰[1];③镧系螯合物激发光光谱较宽,最大激发波长在300～500nm,可通过增加激发光能量来提高灵敏度。而它的发射光谱带很窄,甚至不到10nm,可采用只允许发射荧光通过的滤光片,进一步降低本底荧光;④Eu3+等镧系标记物与放射性同位素相比不受半衰期的影响。如125I标记试剂最长可用3个月,酶标记物常因其纯度、显色底物不稳定等问题,使其应用受到限制。Eu3+与双功能螯合剂螯合,可形成稳定的螯合物,稳定性很高,2年内能保证质量。再者,Eu3+标记物体积很小(为原子标记),标记后不会影响被标记物的空间立体结构,这既保证了被检测物质的稳定性(尤其对蛋白质影响更小),又可实现多位点标记[2]。标记物稳定就可以对标记物进行多次激发,通过对每次激发的荧光信号累加后取平均值的办法,可大大减少偶然误差,提高准确度。同时多位点标记技术,不仅使检测更灵敏,也使一个试剂盒能够同时检测出两种或两种以上的项目。

2.1.2　稀有元素双功能螯合剂　稀土元素作为金属离子,很难直接与抗原抗体结合,因此在标记时需要有一种双功能基团的螯合物,它们分子内或带氨基和羧基或带有异硫氰酸基和羧酸基,一端与稀土离子连接,一端与抗原或抗体的自由氨基(组氨酸、酪氨酸)连接。目前常用镧系元素标记的双功能螯合剂有异硫氰酸2苯基2二乙胺四乙酸(IC B2E DT A)、β2萘甲酰三氟丙酮(β2NT A)、二乙基三胺五乙酸环酐(DTPAA)、4,72二氯磺基苯21,102菲罗啉22,9二羧酸(BCPDA)及对2异硫氰酸2苄基2二乙三胺四乙酸(P2IC B2DTT A)等5种。Y uan等[3]合成出一种稳定的能发出强烈荧光的Eu3+络合剂4,4′2二(1,1′,2,2′,