pSPYCE(MR)植物表达载体
一种植物质体表达载体的构建方法及应用与流程技术
一种植物质体表达载体的构建方法及应用与流程技术构建植物质体表达载体是一种将外源基因导入植物细胞并在植物细胞内进行表达的方法。
以下是一种常见的植物质体表达载体的构建方法及其应用与流程技术：
1.选择载体：选择适合植物质体表达的载体，通常是质粒
（plasmid）或病毒载体。
质粒载体通常由选择标记基因、启动子、终止子和目标基因构成。
2.克隆目标基因：将目标基因（外源基因）插入载体的多克
隆位点中。
这可以通过限制性内切酶切割质粒载体和目标基因的DNA，然后利用DNA连接酶将两者连接起来。
3.构建表达载体：将含有目标基因的质粒进行转化，例如通
过化学方法或电穿孔等手段将质粒导入植物细胞，形成表达载体。
4.选择转化植物细胞：通过对转化植物细胞进行筛选，例如
添加抗性选择剂或利用标记基因表达进行筛选，以筛选出含有目标基因的转基因植物细胞。
5.确认目标基因表达：通过PCR、RNA分析或蛋白质分析等
技术，检测和确认目标基因在转基因植物细胞内的表达情况。
6.稳定转基因植物的培养：将成功表达目标基因的转基因植
物细胞进行培养，以获得稳定转基因植物种子或植株。
7.功能性验证与应用：对获得的稳定转基因植物进行功能性
验证，例如检测表达的蛋白质具有特定的生物活性或应用
于农艺改良、抗病虫害等方面。
8.申请相关许可：如果打算将转基因植物及其产品用于商业
化目的，需要申请相关的许可和审批文件，以确保遵守法
规和伦理规范。
需要注意的是，植物质体表达载体的构建方法与特定目标基因、植物物种和研究目的有关。
植物表达载体构建
植物基因工程常用的报告基因
指其编码产物能够被快速地测定、常用 来判断外源基因是否已经成功地导入寄 主细胞（器官或组织）并检测其表达活 性的一类特殊用途的基因。
作为报告基因的条件
在转化的寄主细胞中应不存在相应的内 源等位基因的活性，
其表达产物不仅不会损害寄主细胞，而 且还应具有快速、灵敏、定量和可重复 的检测特性。
检测方法
用于GUS基因检测的常用底物有三种： X-Gluc 5-溴-4-氯-3-I吲哚-B-D-葡萄糖苷酸酯 X-MUG 4-甲基伞形酮酰-B-D-葡萄糖苷酸酯 PNPG 对硝基苯B-D-葡萄糖醛酸苷 组织化学染色定位法 荧光法测定GUS活性 分光光度法测定GUS活性
组织化学染色定位法
该方法是将底物进入被测的植物组织。 将被检材料浸泡在含有底物的缓冲叶中保温，
cells).
Left, Down regulation of CaMV35S promoter in the syncytium of Heterodera schachtii monitored by expression of GFP (top). By comparison an unifected root shows regular GFP expression (bottom). Right, Image analysis of the mean red component of
植物表达载体构建
张玉刚 zyg4458@
载体 vector
克隆载体
载
体
原核表达载体
表达载体 真核表达载体
植物表达载体
质粒图谱及质粒构建
启动子 外源基因 终止子 启动子 报告基因 终止子
目的片段
（标记基因） 选择标记
植物ip-ms原理
植物ip-ms原理
植物IP-MS（Interaction Partner-Mass Spectrometry）技术是一种用于研究植物分子互作的实验方法。
IP-MS原理主要包括以下几个步骤：
1. 表达载体构建：将目标基因与荧光标签（如GFP）融合，构建表达载体。
将构建好的载体转化到植物材料中，使目标基因表达并产生荧光信号。
2. 植物材料处理：将转化后的植物材料进行适当处理，如切片、破碎等，使细胞内的目标蛋白暴露出来。
3. 蛋白提取：利用蛋白提取试剂盒从植物材料中提取目标蛋白。
提取过程中，要注意保持蛋白的完整性，以便后续实验。
4. 免疫沉淀：利用特异性抗体与目标蛋白结合，将其沉淀下来。
此步骤可用于筛选与目标蛋白相互作用的蛋白。
5. 质谱分析：将沉淀下来的蛋白进行质谱分析，获取蛋白质组分及其相对丰度信息。
6. 数据处理与分析：通过质谱数据分析，找出与目标蛋白相互作用的蛋白，并建立分子互作网络。
IP-MS技术具有较高的准确性，可以同时研究多个基因之间的相互作用。
与其他分子互作技术相结合，IP-MS技术有助于深入了解植物分子互作的机制，为研究植物生长发育、抗病性、逆境响应等生物学问题提供重要线索。
油松DELLA蛋白结合GID1关键位点的鉴定和验证
油松DELLA蛋白结合GID1关键位点的鉴定和验证杜冉;孙新蕊;钮世辉;李伟【摘要】该研究从油松中分离出2个DELLA蛋白,分别命名为PtDPL和PtRGA;序列保守性分析表明,这2个蛋白具备DELLA和GRAS特异结构域,其进化地位处于石松门和水稻之间,且具有被子植物GID1-DELLA蛋白互作关键位点Δ17结构域;双分子荧光互补结果显示,Δ17结构域是油松GID1与DELLA蛋白相互作用的关键位点.转化拟南芥结果表明,移除Δ17结构域后,Ptdpl-Δ17和Ptrga-Δ17转基因植株对赤霉素响应迟钝,且表现出更低的萌发率,验证了Δ17结构域是油松DELLA蛋白结合GID1的关键作用位点.该实验结果为进一步研究针叶树中GID1-DELLA蛋白互作及赤霉素信号通路调控机制研究奠定了基础.%DELLA proteins works as a repressor and GID1 is the soluble receptor in GA signaling path-ways,but currently little is known about interactive sites of GID1-DELLA in conifers.we cloned two DELLA proteins (PtDPL;PtRGA)from Pinustabuliformis named PtDPL and PtRGA.Sequence analysis showed these two DELLA proteins have DELLA and GRAS specific domains and their evolution distance both are between the rice and lycophyte,and they also have GID1-DELLA interactive sitesΔ17 domain as angiosperm;BiFC proved thatΔ17 domain was key sites of interactions between the PtGID1-PtDELLA;WithoutΔ17 domain,Ptdpl-Δ17 and Ptrga-Δ17 mutants showed a strong GA-insensitive phenotype com-pared to wild-type,suggestingthatΔ17 domain is the key interactive sites in conifers GID1-DELLA inter-action.This research provides the basis for GID1-DELLA interaction and GA signaling pathways mecha-nism.【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2017(037)001【总页数】8页(P32-39)【关键词】油松;赤霉素;PtDELLA与PtGID1蛋白互作;BiFC;【作者】杜冉;孙新蕊;钮世辉;李伟【作者单位】北京林业大学林木育种国家工程实验室,林木花卉遗传育种教育部重点实验室,生物科学与技术学院,北京 100083;北京林业大学林木育种国家工程实验室,林木花卉遗传育种教育部重点实验室,生物科学与技术学院,北京 100083;北京林业大学林木育种国家工程实验室,林木花卉遗传育种教育部重点实验室,生物科学与技术学院,北京 100083;北京林业大学林木育种国家工程实验室,林木花卉遗传育种教育部重点实验室,生物科学与技术学院,北京 100083【正文语种】中文【中图分类】Q789赤霉素(gibberellins, GAs)是四环二萜类植物激素，参与调节植物整个生命周期中生长发育的许多方面，能够促进种子萌发、下胚轴伸长，调控木质部发育，诱导花芽分化，增强植物抗逆性等[1-3]。
利用分裂泛素酵母双杂交技术钓取小麦TaSC互作蛋白质
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(3): 423 430 /zwxb/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@本研究由国家自然科学基金项目(30871471), 河北省自然科学基金项目(C2011205085), 河北省自然科学基金基地项目(08B019)和河北师范大学博士基金(L2005B20)资助。
*通讯作者(Corresponding author): 赵宝存, E-mail: baocunzh@, Tel: 0311-********第一作者联系方式: E-mail: linfangfang1227@Received(收稿日期): 2012-07-09; Accepted(接受日期): 2012-11-16; Published online(网络出版日期): 2013-01-04. URL: /kcms/detail/11.1809.S.20130104.1734.013.htmlDOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00423利用分裂泛素酵母双杂交技术钓取小麦TaSC 互作蛋白质蔺芳芳 杨 旭 武小翠 刘晓梅 葛荣朝 赵宝存*河北师范大学生命科学学院, 河北石家庄 050024摘 要: TaSC (Triticum asetivum L. salt-tolerance related gene, GenBank 登录号为AY956330)是从小麦耐盐突变体RH8706-49中克隆的高盐诱导表达的耐盐相关基因。
以该基因编码的蛋白质TaSC 为诱饵, 运用分裂泛素酵母双杂交技术从小麦cDNA 表达文库中钓取互作蛋白质, 筛选到一个编码小麦未知功能蛋白质的基因(GenBank 登录号为AK336035), 命名为TaSCIP1 (TaSC interaction protein 1)。
双分子荧光互补(BiFC)实验证实TaSCIP1与TaSC 存在互作。
植物ip-ms原理
植物ip-ms原理
植物IP-MS（Immunoprecipitation-Mass Spectrometry）是一种用于研究植物蛋白质相互作用和信号传导的重要技术。
它结合了免疫沉淀和质谱分析的优势，能够帮助科研人员深入了解植物细胞内蛋白质的功能和相互作用网络。
植物IP-MS的原理基本上可以分为以下几个步骤：
1. 免疫沉淀（Immunoprecipitation），首先，研究人员需要利用特异性抗体将感兴趣的蛋白质与其相互作用的蛋白质结合成复合物。
这一步骤通常需要对植物细胞进行蛋白质提取和抗体结合处理。
2. 蛋白质分离和洗涤，接下来，复合物需要进行分离和洗涤，以去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质。
3. 洗脱和质谱分析（Mass Spectrometry），经过洗涤后的蛋白质复合物被洗脱出来，并进行质谱分析。
质谱分析可以确定蛋白质的身份和相互作用蛋白质的数量，从而揭示植物细胞内蛋白质相互作用的网络和信号传导通路。
植物IP-MS技术的应用可以帮助研究人员揭示植物细胞内复杂的蛋白质相互作用网络，从而深入了解植物的生长发育、逆境应答等重要生物学过程。
同时，它也为植物蛋白质组学研究提供了强大的工具，有助于发现新的植物蛋白质及其功能。
因此，植物IP-MS 技术在植物生物学研究中具有重要的应用前景。
植物表达载体构建
（三）中间表达载体的构建：
中间载体从功能上看可分为两大类：克隆 载体和表达载体。
克隆载体的主要功能是复制和扩增基因； 表达载体是适于在受体细胞中表达外源基 因的载体。
中间表达载体含有植物特异启动子，因而 能在植物中表达外源基因。
（三）中间表达载体的构建
1．启动子及其它调控序列：
转录的调控对真核生物基因表达起着关键的作用。大多 数真核生物在转录起始点的 5’ 端上游区第 30 至 25bp 处具有 TATA盒，在70至 80bp处还有 CAAT盒；3’ 端具有AATAA序 列。Ti质粒的Nos、Ocs、Tmr等基因都具有与真核生物启动 子类似的 TATA 盒和 CAAT 盒，均能在植物细胞中表达，且 无组织特异性。因此，它们成为早期构建嵌合基因的启动子， 其中以Nos启动子（pNos）最常用。后来发现，由CaMV35s 启动子、外源结构基因和Nos 3’端的非编码区域组成的嵌合 基因，能在植物细胞中高效表达。 CaMV35s 启动子既无组 织特异性，又不受发育时期的影响，是一个较理想的植物基 因工程启动子。 现在已发现很多诱导启动子和特异表达的启动子，被用 于各种不同的转化目的。
2．常用的中间载体及其构建： （1）广谱中间载体： 所谓广谱中间载体是由大肠杆菌广谱质粒克隆 T-DNA片段后 构建而成的。常用的广谱质粒是 RK2 衍生的载体 pRK290 。 由它构建的中间载体既能在大肠杆菌中复制，又能在农杆菌 中复制。
广谱中间载体的构建过程见下图。 ①将选定的T-DNA片段克隆到大肠杆菌质粒上； ②将外源基因连同细菌选择标记（如抗生素抗性）一起插入 到T-DNA片段的限制性切点中； ③将产生的 T-DNA“ 工程”片段亚克隆或共整合到广谱质粒 pRK290。 由于 pRK290 具有在广寄主范围中复制和接合转移的起点， 因而在辅助质粒如 pRK2013 反式动员作用下， pRK290 即可 从大肠杆菌转入根癌农杆菌中。
抗病毒蛋白Y3与TMV-CP的体内互作研究
抗病毒蛋白Y3与TMV CP的体内互作研究烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)是一种RNA病毒,具有广泛的寄主,不仅能感染烟草等茄科植物,使它们引起花叶病,还能感染310种以上其他植物,因此,研究者都在迫切寻找烟草花叶病毒病的防治方法。
相对于一些化学药剂所带来的环境污染和易对作物产生药害等问题,探索天然产物用于烟草花叶病毒的防治,显然是一条可持续发展途径。
近十多年来,不断有研究工作者发现植物或真菌提取物对TMV具有抗性。
Y3是一种能够降低TMV侵染率的天然活性蛋白质,它是从真菌毛头鬼伞(Coprinus comatus)中提取出的,有研究表明Y3蛋白对TMV的外壳蛋白(TMV CP)有体外钝化的作用,使病毒蛋白不能顺利合成,从而达到抑制烟草花叶病毒的作用。
已有研究通过酵母双杂交技术证明了Y3蛋白能与TMV CP在体外有相互作用,为进一步探究Y3蛋白与TMV CP是否在烟草细胞内有相互作用且寻找互作位点,本研究采用双分子荧光互补技术,首先将y3基因、TMV CP基因分别与双分子荧光互补载体pSPYNE(R)173、pSPYCE(M)相连,成功获得了融合表达载体pSPYNE(R)173-y3和pSPYCE(M)-CP,然后将他们分别转化入农杆菌GV3101中,利用渗透注射法导入烟草叶片下表皮细胞中,其后用激光共聚焦扫描显微镜观察到烟草细胞内有荧光信号,结果表明Y3蛋白与TMV CP在烟草细胞内发生了相互作用。
为进一步研究Y3蛋白与TMV CP的互作位点,利用蛋白质序列分析软件分析Y3蛋白的相关功能结构域,发现其第23到26位氨基酸是CK2磷酸化位点,从而利用PCR介导的定点突变技术,将与荧光载体pSPYNE(R)173相融合的Y3蛋白的第23位丝氨酸(TCA)突变为丙氨酸(GCA),再将获得的突变体与融合载体pSPYCE(M)-CP共同导入烟草叶片下表皮细胞中,利用激光共聚焦扫描显微镜观察到仍有荧光信号,证明此位点的突变没有影响到Y3蛋白与TMV CP的相互作用,由此可判断该位点可能不是这两个蛋白的相互作用位点。
几种新型植物基因表达载体的构建方法
几种新型植物基因表达载体的构建方法摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。
植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体PCR 置换法适用于构建小分子RNA 表达载体；重组融合PCR 法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法(Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。
本文将在总结分析前人工作的基础上，分析这6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。
关键词:Micro RNA 前体PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。
而载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。
随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。
传统的载体构建方法在进行构建多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的载体构建方法具有重要的现实意义。
从1969 年Arber 等发现了限制性切酶，载体的构建方法逐步发展，从传统构建方法到三段T-DNA、Gateway 等技术延伸出了许多新的载体构建方法。
本文结合自己的实验工作选择介绍了近年来其中几种新型的具有代表性的植物表达载体构建的方法，对其应用的方向、优缺点作出了评估，期望给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。
植物表达载体构建
2．常用的中间载体及其构建： （1）广谱中间载体： 所谓广谱中间载体是由大肠杆菌广谱质粒克隆 T-DNA片段后 构建而成的。常用的广谱质粒是 RK2 衍生的载体 pRK290 。 由它构建的中间载体既能在大肠杆菌中复制，又能在农杆菌 中复制。
广谱中间载体的构建过程见下图。 ①将选定的T-DNA片段克隆到大肠杆菌质粒上； ②将外源基因连同细菌选择标记（如抗生素抗性）一起插入 到T-DNA片段的限制性切点中； ③将产生的 T-DNA“ 工程”片段亚克隆或共整合到广谱质粒 pRK290。 由于 pRK290 具有在广寄主范围中复制和接合转移的起点， 因而在辅助质粒如 pRK2013 反式动员作用下， pRK290 即可 从大肠杆菌转入根癌农杆菌中。
（ 1 ）共整合系统中间载体：含有与 Ti 质粒 T-DNA 区同源的 序列，此外含有pBR的序列，在其被引入农杆菌后即可高频 地与Ti质粒的T-DNA的同源序列进行重组；具有一个或多个 细菌选择标记，这将有利于筛选共整合质粒；具有 bom位点 （接合转移位点），在有诱导质粒存在的情况下，bom位点 的存在可使中间载体在不同细菌细胞内进行转移；含有植物 阳性选择标记，例如可赋予转化植物细胞卡那霉素抗性的新 霉素磷酸转移酶（neomycin phosphoransferase，Npt-II）基 因，以利于转化植物细胞的筛选；含有单一的限制性内切酶 切点，以利于外源基因的插入；无 Ti 质粒的边界序列 ( 见下 图 )。 （ 2 ）双元载体系统中间载体：其与共整合载体的不同之处 是：无同源序列；具有LB和RB；无ColE复制点。
（四）植物基因转化载体系统的构建：
上述构建的中间表达载体仍然不能直接作为植物外 源基因转化的载体，因为中间表达载体仍是一种细菌 的质粒，不能把外源基因转化到植物细胞。因此，必 须进一步把中间载体引入到上述已改造的受体 Ti 质粒 中，并构建成能侵染植物细胞的基因转化载体，才能 应用于植物基因的转化。它是由两种以上质粒构成的 复合型载体，故称之为载体系统。
拟南芥E3泛素连接酶AtARRE与ABI5相互作用分析
拟南芥E3泛素连接酶AtARRE与ABI5相互作用分析李褚喆;王博雅;李颖;李旭锋;刘志斌【摘要】为了阐述AtARRE与ABA信号通路关键转录因子ABI5的作用,本研究采用原生质体瞬间表达系统探究了AtARRE蛋白的亚细胞定位,证明AtARRE蛋白定位于细胞核.随后,采用酵母双杂交和GST-Pull down技术分析了AtARRE与ABI5在体外的相互作用,证明AtARRE与ABI5在体外存在相互作用.最后,本研究采用双分子荧光互补实验进一步分析AtARRE与ABI5在体内的相互作用,结果表明共表达AtARRE与ABI5在植物体内存在相互作用.这些结果共同表明AtARRE可能参与了ABI5介导的植物对逆境的响应.【期刊名称】《四川大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2019(056)002【总页数】6页(P363-368)【关键词】拟南芥;E3连接酶;脱落酸;AtARRE;脱落酸不敏感蛋白5【作者】李褚喆;王博雅;李颖;李旭锋;刘志斌【作者单位】四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,成都610065;四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,成都610065;四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,成都610065;四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,成都610065;四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,成都610065【正文语种】中文【中图分类】Q781 引言每年由于非生物胁迫的影响导致农作物降低50%以上的产量,这是世界范围内的作物损失的主要原因之一[1, 2].为了应对非生物胁迫,植物进化出了响应非生物胁迫的调控机制,而转录后调控机制是其中重要的部分[3].泛素化-蛋白酶途径通过转录后水平的调控作用广泛地参与到了植物细胞周期、凋亡等生命活动过程[4].泛素小分子依赖于泛素激活酶E1,泛素结合酶E2和泛素连接酶E3结合到靶蛋白上形成多聚泛素链,被26s蛋白酶识别并降解被泛素化修饰的蛋白.当植物受到逆境胁迫的时候,应对胁迫的蛋白质水平迅速增加,但是蛋白浓度累积到一定程度就会对植物的代谢产生毒害作用.因此,当胁迫消失时,累积的蛋白质需被降解处理,以保持植物体内蛋白的内稳态平衡.RING结构E3连接酶作为泛素化-蛋白酶途在响应非生物胁迫具有重要调节作用,如干旱或盐胁迫[5-9].ABA是中央调控因子在许多植物对环境胁迫的响应过程,例如,ABA起到了极其重要的作用在渗透胁迫[10,11].ABA已被证明调节和参与植物发育(如蛋白质和脂类合成)、许多农艺性状(如种子脱水、休眠、发芽)、生殖生长[12-14].此外,ABA介导植物响应非生物胁迫如干旱胁迫、盐胁迫、冷胁迫、病原生物胁迫[12-15].ABA 信号通路中的正调控因子能够被E3连接酶泛素化,从而通过26s蛋白酶途径降解.ABI5是ABA信号通路中一个的转录因子,其对多种胁迫响应的正调控作用主要通过编码 bZIP 家族蛋白来达成[16].此外,多项研究已经证明ABI5参与了依赖于ABA 的胁迫响应途径,是 ABA 信号通路中极其重要的转录因子[17,18].本实验室前期通过酵母双杂交实验筛选出了和拟南芥ABA信号途径中转录因子ABI5相互作用的蛋白AtARRE,进一步实验表明,与野生型拟兰芥相比,AtARRE的T-DNA插入拟南芥突变体在根长和萌发等表型实验上表现出对外源 ABA 的敏感性,并且突变体中响应 ABA 信号通路下游的标志基因较野生型高.因此,前期的研究结果显示AtARRE参与了ABA信号途径,即负调控ABA介导的逆境响应.本文利用酵母双杂交技术、基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法、GST-Pull down实验和双分子荧光互补法(BiFC)对AtARRE与ABI5的相互作用展开了研究.证实AtARRE与ABI5在体外和植物体内均存在相互作用.2 材料与方法2.1 材料哥伦比亚野生型拟南芥 (Col-0)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana),pBI121、pGADT7、pGBKT7-Rec、pGEX-6P-1、pET28a、pSPYNE、pSPYCE载体,农杆菌GV3101、大肠杆菌(E. coli)DH5α菌株、酵母菌AH109菌株、Rosetta菌株,均为实验室保存.GST Resin购于Trans gene,His Resin购于Thermo Fisher.引物合成和测序由擎科生物和华大基因完成.2.2 实验方法2.2.1 目的基因的分离和载体的构建以实验室保存的cDNA为模板,加入Primerstar Max DNA 聚合酶和相应的引物,PCR扩增得到目的基因片段:全长ABI5、AtARRE和截短的ABI5.随后,构建载体:pBI121-AtARRE-GFP、pGADT7-ABI5、pGADT7-ABI5ΔN、pGADT7-ABI5ΔC、pGBKT7-AtARRE、pET28a-AtARRE和pGEX-6P-1-ABI5、pSPYNE-AtARRE、pSPYCE-ABI5、pSPYCE-ABI5ΔC、pSPYCE-ABI5ΔN.2.2.2 原生质体转化取拟南芥叶片切成细丝,放入原生质体酶解液,22 ℃ 黑暗酶解约3 h后加入4 mL 预冷的W5,并用4层纱布过滤.离心去上清,并用4 mL 预冷的W5洗涤两次.弃上清,加入1 mL W5,冰上放置30 min.弃上清,加入1 mL MMg.取10～20 μL pBI121-AtARRE-GFP质粒、100 μL原生质体和110 μL 40%PEG4000,混匀放置20 min.加入440 μL W5终止反应,然后用1 mL W5洗涤原生质体三次,于22 ℃黑暗培养16 h,用荧光倒置显微镜观察.2.2.3 酵母双杂交及X-Gal染色分别共转化载体pGADT7-ABI5、pGADT7-ABI5ΔN、pGADT7-ABI5ΔC和pGBKT7-AtARRE至AH109酵母感受态,将酵母细胞涂布于SD/Leu-Trp-平板上,30 ℃培养3～4 d.取阳性菌落接入液体培养基SD/Leu-Trp-, 30 ℃培养2 d,用0.9%NaCl将样品调至OD600=0.5.将样品稀释10、100、1000倍,分别取5 μL滴定在SD/Leu-Trp-、SD/ His-Trp-Leu-平板上,30 ℃培养3～4 d,观察菌落生长情况.用滤纸覆盖酵母平板并使滤纸与菌落充分接触,用液氮冷冻滤纸.将滤纸和6 mL反应液放入平板,30 ℃放置8～12 h.2.2.4 蛋白质纯化及GST-Pull down 将pET28a-AtARRE和pGEX-6P-1-ABI5转入Rosetta菌株,按照蛋白纯化的步骤诱导并纯化出AtARRE、ABI5、GST蛋白.向EP管加入40 μL GST Resin,再加入ABI5及AtARRE蛋白各5 μg,最后加入Incubation buffer至体系总体积为500 μL,将样品置于4 ℃ 下360°旋转的摇床上旋转2 h.用1mL Washing buffer清洗4～5次,再进行Western Blot检测. 2.2.5 双分子荧光互补将pSPYNE-AtARRE、pSPYCE-ABI5、pSPYCE-ABI5ΔC、pSPYCE-ABI5ΔN载体转入农杆菌,28 ℃培养过夜.离心10 min收集菌体,弃上清,用等量侵染液清洗3次,再用侵染液重悬使OD600=1.0～1.2.静置1 h,取等量上层液体混合,用1 mL注射器以压力注射法共同瞬时转化烟草叶片2 d, 用激光共聚焦显微镜观察.3 结果与分析3.1 AtARRE的亚细胞定位为了确定AtARRE的亚细胞定位,我们克隆了AtARRE基因的cDNA序列,并利用pBI121载体构建了AtARRE与绿色荧光蛋白(GFP)的重组载体pBI121-AtARRE-GFP.运用原生质体转化法将重组载体pBI121-AtARRE-GFP和pBI121-GFP空载体导入拟南芥原生质体,使之瞬时表达并在荧光倒置显微镜下观察在拟南芥原生质体中的荧光信号,以确定AtARRE蛋白的亚细胞定位.如图1所示,瞬时表达结果显示有明显的绿色荧光出现在拟南芥原生质体中,说明pBI121-AtARRE-GFP 融合蛋白载体和空载体均成功转入了拟南芥原生质体并成功表达,并且AtARRE-GFP 融合蛋白的绿色荧光信号存在于拟南芥原生质体的细胞核,而对照GFP则表达在整个原生质体中.该实验结果证明AtARRE蛋白定位于拟南芥细胞核,即AtARRE的表达位置在细胞核中.图1 AtARRE的亚细胞定位Fig.1 Subcellular location of AtARRE3.2 酵母双杂交验证AtARRE与ABI5体外的相互作用为了确定ABI5和AtARRE的相互作用,我们克隆了AtARRE和ABI5基因的全长cDNA序列,并利用pGADT7和pGBKT7-Rec载体构建了重组载体pGBKT7-AtARRE和pGADT7-ABI5.运用酵母双杂交技术共转化重组载体pGBKT7-AtARRE和pGADT7-ABI5,并在SD/Trp-Leu-与SD/ Trp-Leu-His-平板上培养该酵母细胞,观察菌落在SD/Trp-Leu-与SD/ Trp-Leu-His-平板上的生长情况.如图2所示,pGADT7-ABI5+pGBKT7-AtARRE转入酵母后,在SD/Trp-Leu-和SD/ Trp-Leu-His-平板上长出白色、光滑、丘状的菌落,说明酵母转化成功,且ABI5和AtARRE能够在酵母系统中发生相互作用.为了进一步确认ABI5和AtARRE相互作用的位置,我们从ABI5 氨基酸序列的第 271 位将 ABI5 蛋白截短为N端和C端两部分,并构建了重组载体pGADT7-ABI5ΔN和pGADT7-ABI5ΔC.将pGADT7-ABI5ΔN+pGBKT7-AtARRE和pGADT7-ABI5ΔC+pGBKT7-AtARRE转入酵母后,观察菌落在SD/Trp-Leu-与SD/ Trp-Leu-His-平板上的生长情况.如图2所示,pGADT7-ABI5ΔN+pGBKT7-AtARRE和pGADT7-ABI5ΔC+pGBKT7-AtARRE转入酵母后,在SD/Trp-Leu-平板上长出白色、光滑、丘状的菌落,说明酵母转化成功.然而,只有pGADT7-ABI5ΔN+pGBKT7-AtARRE能够在SD/ Trp-Leu-His-平板上长出菌落,而pGADT7-ABI5ΔC+pGBKT7-AtARRE则不能,即ABI5ΔN和AtARRE能够在酵母系统中发生相互作用.综上所述,酵母双杂交初步表明ABI5和AtARRE可以在酵母系统中发生相互作用,且作用的位置在ABI5的C端. 图2 酵母双杂交检测AtARRE与ABI5体外的相互作用Fig.2 Detection of interaction between AtARRE and ABI5 by yeast two hyb rid system in vitro 3.3 GST-Pull-Down验证AtARRE与ABI5体外的相互作用为了确定AtARRE与ABI5体外的相互作用,我们利用载体pGEX-6P-1、pET28a构建了ABI5、AtARRE的重组载体pET28a-AtARRE和pGEX-6P-1-ABI5,并利用原核表达和亲和纯化得到纯度较高的His-AtARRE、GST-ABI5、GST蛋白,然后采用体外GST-Pull Down验证AtARRE与ABI5在体外的相互作用.实验以10% His-AtARRE +GST-ABI5作为实验组,10% His-AtARRE +GST作为负对照,5% Input作为阳性对照.如图3所示,His-AtARRE+GST-ABI5和Input均可见一条单一的目的条带,而对照组His-AtARRE+GST则不能,说明以GST树脂作为亲和材料,GST-ABI5作为诱饵蛋白,能够吸附His-AtARRE蛋白.实验结果证明His-AtARRE和GST-ABI在体外存在相互作用.图3 GST-Pull Down检测AtARRE与ABI5体外的相互作用Fig.3 Detection of interaction between AtARRE and ABI5 by Pull-Down in vitro图4 BiFC检测AtARRE与ABI5体内的相互作用Fig.4 Detection of interaction between AtARRE and ABI5 by BiFC in vivo3.4 BiFC验证AtARRE与ABI5体内的相互作用为了验证AtARRE与ABI5在植物体内的相互作用,我们利用双分子表达载体pSPYNE和pSPYCE构建了ABI5、AtARRE的重组表达载体pSPYNE-AtARRE和pSPYCE-ABI5.利用烟草侵染法将构建好的重组载体pSPYNE-AtARRE和pSPYCE-ABI5共转化至烟草叶片中,培养2 d后用激光共聚焦显微镜观察荧光信号的表达情况.双分子荧光互补实验(BiFC)结果显示共转化pSPYNE-AtARRE+pSPYCE-ABI5能够在烟草叶片细胞中观察到荧光信号,说明AtARRE与ABI5在体内存在相互作用.为了进一步验证AtARRE与ABI5在体内的相互作用的位点,我们构建了重组载体pSPYCE-ABI5ΔC(缺失C端)和pSPYCE-ABI5ΔN(缺失N端)并将之分别和pSPYNE-AtARRE共转化至烟草细胞.BiFC结果显示pSPYNE-AtARRE+pSPYCE-ABI5ΔN能够观察到荧光,而pSPYNE-AtARRE+pSPYCE-AB I5ΔC则无法观察到荧光,说明AtARRE与ABI5在体内存在相互作用的位置在ABI5的C端.值得注意的是,AtARRE+pSPYCE-ABI5ΔN荧光的强度明显比pSPYNE-AtARRE+pSPYCE-ABI5弱,说明ABI5和AtARRE发生相互作用的位置在ABI5的C端,但是ABI5的N端也起到了辅佐作用,这与酵母双杂交的结果是一致的.4 讨论植物对非生物胁迫的响应涉及许多分子途径的相互作用[19].在胁迫条件下,许多基因发生上调使植物能够承受胁迫,因此形成植物的适应[20].在非生物胁迫的响应中担任信号的是各种化学物质,如钙(Ca2+)、糖、生长素(IAA)、脱落酸(ABA)等,不同的信号通路既相互独立也相互影响[21].植物激素参与植物对非生物胁迫的耐受性和适应作用,最重要的两种激素是脱落酸(ABA)和乙烯[22].作为重要的植物激素,ABA在植物耐受性的形成中起到了重要的调节作用,信号通路通过ABA诱导生产和积累在ABA信号转导中起重要作用的第二信使,如Ca2+、磷脂酸(PA)和活性氧(ROS)等[23].因此,ABA信号通路和其涉及的各种蛋白是研究植物抗逆的重要课题.拟南芥有超过1400种E3连接酶,这表明E3连接酶是底物特异性的主要决定因素,因此,作为泛素化-蛋白酶途径的重要组成部分的E3连接酶也是目前研究植物抗逆机制的重点.作为植物抗逆的一个重要的途径,ABA信号途径中有多个转录因子参与植物与ABA相关胁迫的应答过程.这些转录因子可能被泛素化途径识别靶定,并通过26s蛋白酶体途径降解来调控植物的应答反应.泛素化系统中E3连接酶起着识别与靶定底物的作用,因而研究E3连接酶与底物蛋白的作用对于研究植物的胁迫响应有着重要意义.经过本实验室前期研究发现AtARRE负调控ABA信号途径并鉴定了AtARRE的E3连接酶活性.基于以上研究成果,本研究利用酵母双杂交技术、基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法、GST-Pull down实验和双分子荧光互补法(BiFC)对AtARRE与ABI5的相互作用展开了研究.结果显示,AtARRE与ABA信号途径中的转录因子ABI5存在相互作用,且AtARRE主要与ABI5的C端存在相互作用.因此,我们的研究结果预示了AtARRE可能通过泛素化修饰ABI5来负调控ABA信号途径,进而调节拟南芥响应非生物胁迫.为了进一步揭示AtARRE与ABI5之间的关系,清楚AtARRE在ABA信号途径中的调控作用,最终达到了解植物抗逆分子机制的目的,后期的研究需要利用体外泛素化和Co-IP等研究手段,从体外和体内两个角度研究AtARRE是否能够泛素化修饰ABI5,从而探究AtARRE在ABA信号途径中的功能.参考文献:【相关文献】[1] Bray E A, 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The Arabidopsis RING finger E3 ligase RHA2a is a novel positive regulator of abscisic acid signaling during seed germination and early seedling development [J]. Plant Physiol, 2009, 150: 463.[8] Liu H, Stone S L. Abscisic acid increases Arabidopsis ABI5 transcription factor levels by promoting KEG E3 ligase self-ubiquitination and proteasomal degradation [J]. Plant Cell, 2010, 22: 2630.[9] Li H, Jiang H, Bu Q, et al. The Arabidopsis RING finger E3 ligase RHA2b acts additively with RHA2a in regulating abscisic acid signaling and drought Response [J]. Plant Physiol, 2011, 156: 550.[10] Takahashi S, Seki M, Ishida J, et al. Monitoring the expression profiles of genes induced by hyperosmotic, high salinity, and oxidative stress and abscisic acid treatment in Arabidopsis cell culture using a full-length cDNA microarray [J]. Plant Mol Biol, 2004, 56: 29.[11] Tuteja N. Cold, salinity, and drought stress [C]// Plant stress biology: from genomics to systems biology. 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一种用于实时检测植物体内水杨酸水平的植物表达载体及其应用[发明专利]
![一种用于实时检测植物体内水杨酸水平的植物表达载体及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/0c9a14e077eeaeaad1f34693daef5ef7ba0d12ca.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610439637.X(22)申请日 2016.06.16(71)申请人 浙江省农业科学院地址 310025 浙江省杭州市石桥路198号(72)发明人 赵晋平 李赛赛 燕飞 程晔 陈剑平 (74)专利代理机构 杭州千克知识产权代理有限公司 33246代理人 黎双华(51)Int.Cl.C12N 15/82(2006.01)G01N 21/64(2006.01)(54)发明名称一种用于实时检测植物体内水杨酸水平的植物表达载体及其应用(57)摘要本发明公开了一种用于实时检测植物体内水杨酸水平的植物质粒表达载体,其中，通过把该质粒载体接种到植物体中，实时检测植物体中SA水平，其中，所述的质粒载体从右到左包括如下结构：T-DNA右边界元件序列-35S启动子元件序列-第一酶切位点-NPR1的泛素-26s蛋白酶体降解元件基因序列-第一接头序列-荧光序列-第二接头序列-细胞核定位蛋白(NLS)序列-终止子序列-35S启动子序列-T-DNA左边界序列，其中，该质粒载体所表达的融合蛋白能够特异被SA所以降解。
通过该质粒载体在植物体中的表达，可以实时监测植物体内的SA的水平。
权利要求书1页 说明书7页序列表6页 附图3页CN 105969795 A 2016.09.28C N 105969795A1.一种用于实时检测植物体内水杨酸水平的植物质粒表达载体,其中，通过把该质粒载体接种到植物体中，实时检测植物体中SA水平，其中，所述的质粒载体从右到左包括如下结构：T-DNA右边界元件序列-35S启动子元件序列-第一酶切位点-NPR1的泛素-26s蛋白酶体降解元件基因序列-第一接头序列-荧光蛋白序列-第二接头序列-细胞核定位蛋白(NLS)序列-终止子序列-35S启动子序列-T-DNA左边界序列，其中，该质粒载体所表达的融合蛋白能够特异被SA所以降解。
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pSPYCE(MR)
编号 载体名称
北京华越洋生物VECT0380 pSPYCE(MR)
pSPYCE(MR)载体基本信息
出品公司: -‐-‐
载体名称: pSPYCE(MR)
质粒类型: 植物双元表达载体
高拷贝/低拷贝: -‐-‐
启动子: -‐-‐
克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶
载体大小: -‐-‐ 5' 测序引物及序列: -‐-‐ 3' 测序引物及序列: -‐-‐ 载体标签: -‐-‐ 载体抗性: -‐-‐ 筛选标记: -‐-‐ 备注: -‐-‐ 产品目录号: -‐-‐ 稳定性: -‐-‐ 组成型: -‐-‐ 病毒/非病毒: -‐-‐
pSPYCE(MR)载体简介
其他植物载体质粒：
pBI101 pDF15
pBI121 pEarleyGate 100
pBI221 pEarleyGate 101
pBI221-‐GFP pEarleyGate 102
pBin19 pEarleyGate 103
pBINPLUS pEarleyGate 104
pCambia0105.1R pEarleyGate 201
pCambia0305.1 pEarleyGate 202
pCambia0305.2 pEarleyGate 203
pCambia0380 pEarleyGate 204
pCambia0390 pEarleyGate 205
pCambia1105.1 pEarleyGate 301
pCambia1105.1R pEarleyGate 302
pCambia1200 pEarleyGate 303
pCambia1201 pEarleyGate 304
pCambia1281Z pFGC5941
pCambia1291Z pGA643
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pTCK303 pSAT1-‐cCFP-‐C Super1300 pSAT1-‐cCFP-‐N pSAT6nCeruleanC(A+) pSAT4-‐nVenus-‐C。