小标本和细胞学标本的基因检测(病理科)ppt课件

Capillary Sequencing
Clean-up
O
O
= Transfer product /add reagent/ open tube
20~30%
Capillary Sequencing
<1%
Steps 1 2 3 4 5 6 7
测序法与ARMS法应用
ISEL Biomarker 测序法阴性样 本（～200） ARMS法重 新检测 17(+) 测序法复测 7(+)
O
PCR/ RFLP
PCR
O
PCR/ HRMA/ dHPLC
Pቤተ መጻሕፍቲ ባይዱR
Nested PCR/ ME-PCR/ PCR/ Sequencing Sequencing Sequencing
PCR
O
PCR
O
PCR
O
1%
~10%
Clean-up
O
SURVEYOR cleavage
O
RFLP
O
Heteroduplex
细针穿刺活检
标本较小 通常是福尔马林固定、石蜡包埋处理 建议采用灵敏度高的检测方法
细胞学标本
涂片、染色 胸水或支 气管刷片 液基细胞学
细胞蜡块，切片染色
病理诊断 病理诊断 病理诊断
•
细胞学标本中通常肿瘤细胞数目较少，需要采用灵敏度高的检测方法
•
•
利用染色后的细胞涂片直接刮片，提取DNA，用于基因检测
小标本和细胞学标本的 EGFR突变检测
肿瘤组织的异质性
遗传异质性
正常细胞混杂
检测方法的比较
ARMS & PNA-LNA clamp
PCR: Real-time Detection
TaqMan
PCR: Real-time Detection
Pyro Sequencing
PCR
O
PCR/ SURVEYOR PCR
O
Clean-up
O
PCR
O
RFLP
O
Pyrosequencing Rxn
dHPLC Sizing
O
Electrophoresis Sizing
O Confirmation by sequencing
Capillary Electrophoresis
O
Confirmation by sequencing
EBUS-TBNA样品可以用于EGFR突变检测
J Clin Oncol 30, 2012 (suppl; abstr e21103)
细胞学样本检测肿瘤EGFR突变
FNA
Pleural fluid
Bronchoalveolar lavage
细胞学样本可以进行EGFR突变检测
Cancer Cytopathol 2009, 117:67-72
制备细胞蜡块：
– 处理流程：细胞学标本经离心处理后，常规福尔马林固定、处理及石蜡包埋 – 制备细胞蜡块的好处： （1）便于长期保存；（2）方便用于EGFR基因突变的检测及其他 分子生物学标记物的检测
标本的病理评估
• 病理组织学诊断：确保肿瘤组织是非小细胞性肺癌 • 肿瘤量：确保有足够的肿瘤组织用于突变检测
J Clin Oncol. 2011, 20;29:3316-3321.
国际肺癌协会专家共识
小标本和细胞学标本的
EGFR突变检测应用
支气管刮取物样本检测肿瘤EGFR突变
支气管刮取物样本可以进行EGFR突变检测
British Journal of Cancer,2006, 95:1070-1075
癌性胸水检测EGFR突变
*用肺腺癌胸水中细胞检测EGFR突变 EGFR 突变状态 测序法
total
ARMS
+
+
3
0
total 3
-
5
8
15
15
20
23
EGFR突变检出率: ARMS法35%；测序法13%
* Kimura et al. Cancer Sci 2006; 7 (7):642-648
用胸水检测肿瘤EGFR突变需要敏感的ARMS方法 其敏感度与特异性尚无结论
病理科医生
-肿瘤科医生 -放疗科医生 -呼吸科医生
实验室人员
胸外科医师 收集肺癌组织标本 病理评估 实验操作及结果分析
多学科的合作是确保基因检测顺利开展和成功的关键 通过对不同类型标本的病理评估，选择合格的样本是 确保基因突变检测成功的重要步骤
BR21后续分析 测序法阴性样 本（n=148）
ARMS法重 新检测 11(+)
1. F Hirsch, et al. JCO 2006；2. C Zhu, et al. JCO 2008 3. T Mok, et al. Discovery Med 2009
测序法与ARMS法应用实例-2
ARMS法比测序法更灵敏，灵敏度为1%
尽量保证200-400个肿瘤细胞
可以尝试进行<200个肿瘤细胞的标本检测 5uM 10张切片能满足突变检测需求
当细胞数较少时,可以适当增加切片数
• 肿瘤比例：一般要求肿瘤比例>20%，否则，需要标识肿瘤丰富的区 域，提高肿瘤细胞比例 尽量去除非肿瘤组织及细胞，提高检测的敏感性 不同敏感性的检测方法对肿瘤比例要求不一样
Sequencing Rxn
O
Clean-up
O
PCR
O
~10%
Confirmation by sequencing
Clean-up
O
Sequencing Rxn
O
Clean-up
O
3-10%
10%
3-12%
Capillary Sequencing
Clean-up
O
Sequencing Rxn
O
20~30%
EBUS-TBNA 样本检测肿瘤EGFR突变
样本数量： 52例
样本种类：EBUS-TBNA
EGFR突变 ：25例（25/52=48%）：15例 9例 1例
exon19 exon21 T790M
检测方法：ARMS方法与突变富集测序，结果一致 验证方法：其中6例样本手术样本的检测结果一致
小标本和细胞学 标本的基因检测 (病理科)教学
内容介绍
•小标本和细胞学标本的获取
•标本的病理学评估
•检测方法的选择 •EGFR突变检测应用
小标本和细胞学标本的获取
内科多手段获取肺癌标本
病理诊断+基因检测
支气管镜活检
标本较小 通常是福尔马林固定、石蜡包埋处理 建议采用灵敏度高的检测方法
不同来源样本的数量要求和检测方法
British Journal of Cancer 2006, 95:1390-1395; Cancer Sci 2006; 97:642-648; Lung Cancer 2006; 54: 265-266
样品基因检测中的相关角色
报告结果给临床医生
患者
临床医生
内镜医师