抗肿瘤药物实验法心得
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破瘤源。消毒，切开皮肤、瘤生长良好（无坏死 或液化），放入无菌平皿，剪成2-3mm3小块。平 皿应置于冰上。无菌套管针抽吸或向套管针内塞 进一小瘤块。一般应在30min内接种完毕。
• (3)瘤细胞悬液的制备：数个瘤块混合，剪成小
块，用玻璃组织匀浆器研磨，生理盐水适量稀释 成l：3或l：4的瘤细胞悬液。
• 1.1动物选择
• 常用小鼠、大鼠和地鼠。每批实验用同一性别（但乳癌、 卵巢癌、宫颈癌等必须用雌性）。
• 1.2肿瘤移植 • (1)一般要求 无菌、低温（消毒不严、瘤块污染常是接种失败的主
要原因）
接种部位: 皮下接种(右前肢腋);肌肉接种(大腿肌肉部);
腹水型接种(腹腔)。
• (2)瘤块制备：取接种7-10天、生长旺盛且无溃
• 【操作步骤】
（1）0.25%胰酶消化对数生长期细胞，5%～10%NBS的RPMI 1640调细胞浓度50000个/ml。96孔板100ul/孔。设溶剂 对照，每组 3-6 平行孔。 37 ℃， 5%CO2、95% 空气的培养 箱中预培养24h，弃上清。 （2）加药物5个10倍稀释的浓度（溶剂常用的有二甲亚砜 和水)，通常为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L。 （ 3 ）细胞连续培养 24 ～ 72h，每孔加入 10 μ l 5mg/ml 的 MTT溶液（以无血清培养基配制），继续培养4h。 （4）吸去上清。加入200μ l DMSO，轻轻振荡以使甲臜完 全溶解。570nm处用酶标仪测定OD值。 （5）计算抑制率(%)=（对照OD-药物OD）/对照OD*100%
抗肿瘤药物实验法
安徽医科大学临床药理研究所 2010.04.30
在抗肿瘤研究中，人们提出了肿瘤多步骤 、 DNA突变、细胞凋亡、细胞周期核心机制、细胞周 期启动及多条信号转导途径参与等许多理论和学说。 抗肿瘤药的研究随着理论的更新和技术的进步， 已从以核酸等为靶点的杀伤型细胞毒药转向对肿瘤 新靶点的研究。包括化学预防药、分化诱导剂、凋 亡诱导剂、信号传导阻滞剂、血管生成抑制剂、肿 瘤耐药逆转剂、生物调节剂以及化放疗保护剂等。 随着新型抗癌药的研究，诞生了许多抗肿瘤药物实 验方法。
（ 2 ）软琼脂集落形成：适用悬浮和贴壁生长细胞。
1）计数对数生长期细胞，15% NBS培养液配成1000个/ml细 胞悬液，37℃温育。 2）取33～35mm培养皿，3复皿，加受试药20μ l。 3）取37℃新鲜培养液9份，加沸水浴中融化的5%琼脂液1份， 摇匀，加入平皿，每个1ml，混匀置室温使琼脂凝固。 4）取预温的细胞悬液按每9.4ml加5%琼脂液0.6ml的比例混 匀，加入已铺底层琼脂的平皿中，每个1ml，置室温使琼 脂凝固。 5）将平皿置5%CO2，37℃孵育箱中培养7～10天。 6）镜下计数直径大于75μ m（50个细胞以上）的集落。
第1节 肿瘤细胞体外筛选方法
一、抗肿瘤药体外方法
动物模型在抗肿瘤药物的评价中起重要的 作用，但动物模型费用高，周期长使其不适 合大规模的抗肿瘤药物评价。因此抗肿瘤药 初步筛选首先应采用肿瘤细胞体外实验方法， 既节约成本又节省时间。
1.MTT法 【基本原理】活细胞线粒体中存在的脱氢酶能够 代谢还原黄色的溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2） -2，5-二苯基四氮唑（MTT）为蓝紫色的甲臜； 而死细胞此酶消失，MTT不被还原。 用DMSO溶解甲臜后，570nm处酶标仪测定其吸光 度（OD值）。 OD值与活细胞数成正比，因此可 根据 OD 值推测出活细胞的数目，了解药物抑制 或杀伤肿瘤细胞的能力。
【结果评定】
（1）剂量反应曲线：以集落抑制百分率与剂量对数作图， 可以得到一条S形曲线并求出药物的半数抑制浓度 （IC50）。 （2）亦可计算各加药组集落形成率。
5、癌细胞分化诱导实验
【基本原理】癌症属于细胞分化异常的疾病。恶性肿 瘤存在着明显的细胞分化受阻。白血病、黑色素瘤、 肝癌、结肠癌、神经母细胞瘤等可在体外被某些化合 物诱导分化为正常细胞或近似正常的细胞。这些发现 为抗肿瘤药物研究开辟了一条新的途径。因此，癌的 分化治疗已成为癌症研究的重要前沿方向之一。
肝癌Bel 7402细胞分化诱导实验 【基本原理】肝癌 Bel 7402 细胞甲胎蛋白（ AFP） 在肝癌中分泌量很高。 γ -GT （半乳糖转移酶） 在癌症发生发展过程中活性逐渐上升。白蛋白 （ALB）及TAT（酪氨酸转氨酶）在分化良好细 胞下降。在体外测定这些蛋白的含量及活性， 用以判断肝癌细胞的分化程度。 AFP及ALB测定 ：AFP、ALB放免测定试剂盒说明 测定AFP及ALB含量 γ -GT 、TAT测定：紫外可见分光光度法。
1.3 移植性动物肿瘤的质量鉴定 (1)每年进行一次实验动物瘤株的组织学检查。 (2) 接种前置37℃培养箱内以检查细菌，霉菌;在接 种和传代过程中，必须严格无菌操作，防止感染。 (3)肿瘤生长潜力的检查 1)实体瘤：若对照组中20％肿瘤<400mg或平均重量 <1g；大鼠肿瘤平均重量小于2g，作废。 2)腹水型肿瘤：对照组平均生存率应在规定范围内。
第2节 肿瘤动物模型体内筛选方法
1.诱发肿瘤动物模型实验法 2.自发肿瘤动物模型实验法 3.移植性肿瘤动物模型实验法 4. 转基因动物肿瘤实验法
• 对诱发肿瘤的评价
• 诱发性肿瘤的病因与由环境因素所诱致人癌情况相似。 癌细胞增殖动力学在两者间亦接近，故动物诱发肿瘤 类似人体肿瘤。 • 但人癌原因十分复杂，诱癌剂不清，肿瘤的病理组织 学与动物不同，发生发展与动物诱发肿瘤不完全一致。 • 诱发肿瘤不仅诱发需时较长，成癌率不高。多数内脏 肿瘤不作解剖，难以判断是否已发生肿瘤。发生时间 先后、发展速度个体差异大。 • 加之化学致癌物的来源比较困难，并随着环境保护意 识的增强对相关的动物实验室提出了更高的要求和限 止，所以本法不宜作一般抗癌药物筛选应用. • 对移植性肿瘤有效的药物，可用本法进一步验证其抗 癌疗效。
• 分化指标包括形态学变化、及生化功能变化 。
• • • • 人早幼粒细胞白血病HL-60细胞的分化诱导实验 HL-60细胞分化为成熟度不同的粒细胞或巨噬细胞 硝基四氮唑蓝（NBT）试验:NBT还原能力应大于50％。 形态学变化的观察:成熟粒细胞所占比例越高，说明分 化效果越好。 • 吞噬功能测定:分化诱导剂的吞噬百分率应在50％以上。
【注意事项】 （1）优点：XTT代谢产物溶解于水，不需要吸去 上清就可测OD值，简单方便，减少误差。 （2）XTT不易被线粒体酶还原，因此同时加入电 子偶联剂 (PMS)。 （3）每孔的XTT量不宜加入太多，高浓度的代谢 产物抑制线粒体酶活性。 （4）XTT和PMS现用现配。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ.染料排斥法检测药物对肿瘤细胞的生长抑 制
移植性肿瘤实验法
• 动物移植性肿瘤实验法是最通用的抗肿瘤方法， 比自发性、诱发性及转基因动物肿瘤容易造模, 成功率高（100％），且能同时获得大量生长 相对均匀肿瘤。 • 一般给药7-10天，第8-11天解剖动物。 • 观察指标：一般状况，体重变化及死亡率，判 断药物是否有明显的抑制肿瘤生长的作用，为 抗癌药物临床疗效提供有意义的依据。 • 动物移植性肿瘤是任何体外试验不能代替的。
• (4)腹水型肿瘤悬液的制备 1)抽取腹水：选择接种后7-10天瘤源动物，腹水 应为乳白色浓稠液体(如黄色或有大量红细胞则弃 去) 。 2)细胞计数：用白细胞计数法计瘤细胞总数。 3)接种：腹水用无菌生理盐水或含葡萄糖的平衡 盐水(如Hanks液、Gey液等)稀释至适当的浓度 （1×107 /ml ），ip每鼠0.2ml。 • (5)白细胞瘤株的接种：腹水型白细胞瘤如P388及 L1210的接种同腹水型肿瘤接种法。
2.XTT法 【基本原理】 XTT 是 MTT 的衍生物，经过 活细胞代谢还原成水溶性的代谢产物， 代谢产物的量与活细胞的数目成正比， 因此利用酶标仪在检测波长465nm处测定 代谢物的 OD 值可以推测活细胞的数量。 数据处理方法同MTT法。
• 【操作步骤】 （1）细胞接种，药物处理均同MTT方法。 （ 2 ）药物处理 24 ～ 72h 后，每孔加 50 μ l XTT 溶 液 （ 内 含 5 0 μ g XTT，5μ l 10mmol/L 的电子偶联剂 (PMS)）继续培 养4h。 （3）96 孔培养板振荡 2 ～ 3min 后，直接用 酶标仪在465nm波长处测OD值。
• 【操作步骤】
（1）贴壁集落形成：适用于几乎所有贴壁生长的细胞。 1）生长期贴壁细胞一瓶，胰蛋白酶消化成单细胞悬液， 活细胞计数，培养基稀释成50～100个细胞/ml。 2）取直径33～35mm培养皿（或15ml培养瓶）或6孔板， 每组3复孔/皿，受试药20μ l，稀释后细胞悬液2ml， 摇匀，5%CO2、37℃培养箱培养7～14天。 3）弃上清， PBS洗 2 次， 2ml/ 次，无水甲醇固定 5min， 静置干燥，用吉姆萨染色或1%结晶紫染色5～10min后， 用自来水冲洗，室温干燥，镜下计数75μ m以上的集落。
【基本原理】 活细胞有排斥染料（如伊红、台盼蓝、苯胺黑等 染色的能力，而细胞死亡后由于膜完整性遭到破 坏，细胞即被着色。
【操作步骤】 （1）25ml培养瓶中加入细胞4×104个、受试药40μ l， 终体积4ml， （2）5%CO2，37℃培养48～96h。 （3）取细胞悬液 0.4ml，加 0.4% 台盼蓝液 0.1ml，在室 温作用5min，在15min内，细胞计数板计数约200个细 胞中死细胞（蓝色）的个数。 【结果评定】 （1）活细胞率%=（未染色细胞数/细胞总数）×100%。 （2）将活细胞率与药物浓度的对数作图，可得到S形剂 量反应曲线，计算半数杀伤浓度（LC50）。 （3）当 LC50<10μ g/ml并能重复时，提示药物应进一步 实验。
对转基因小鼠肿瘤模型的评价 • 该模型较好地再现了人类肿瘤发生发展的完整 变化，包括机体从正常演变为癌前病变进而发 展为恶性肿瘤的全过程，该模型也为相关基因 与肿瘤的关系在整体水平研究和基因药物的研 发提供了良好的手段。 • 但肿瘤的发生受到一个或多个基因的协同调控 的，与转基因小鼠肿瘤模型不同； • 该模型同样存在实验周期长、肿瘤发生时间不 齐、繁育能力较低以及成本较高等缺点。
对自发肿瘤总的评价
• 其肿瘤发生率与瘤细胞动力学特点与人癌近似，生长 较移植肿瘤慢，对药物敏感度不高，疗程较长，故便 于进行综合化疗的研究； • 理论上用带有自发肿瘤模型筛选药物较理想。然而， 动物自发肿瘤的病因取决于的遗传特性，与人癌病因 区别较大。 • 很难在限定期间内得到大量生长均匀的带瘤动物，各 动物肿瘤之间生长速度差异也较大，给评价带来困难。 • 此类肿瘤常用于特殊目的试验或作为“二级筛选”模 型。
【注意事项】
药物杀伤细胞作用可能被低估原因： （ 1 ）存活细胞可能继续繁殖，使活细胞率增高。 （ 2 ）死细胞可能过早地崩解，计数时已不存在， 使死细胞率下降。
4. 集落形成法测定药物对肿瘤克隆原细胞的生 长抑制作用 【基本原理】克隆原细胞指具有持续增殖能力 的细胞。当单个细胞能连续分裂 6 代或以上时， 其后代所组成的群体（集落）含50个以上细胞。 计数集落可以对克隆原细胞作定量分析。反映 了单个细胞增殖潜力，能较灵敏地测定抗肿瘤 药物的活性，目前被认为是一种较理想的检测 方法。 常用的集落形成方法可分为贴壁法及半固体培 养基法。
• 一种药物未必对各种类型的移植性肿瘤有 效，选择某一瘤株供筛选都可能漏筛药物。 • 动物肿瘤的生物学特点与人类有较大的差 距，动物瘤株恶性程度高，生长迅速，对 药物的敏感性比人类自发的癌瘤高得多， 因此，对动物肿瘤生长有抑制的药物对人 癌不一定有效。本法的命中率低。
• 筛选药物时最好采用三种瘤株，即肉瘤、 腹水型肿瘤和白血病株肿瘤。 • 国内用肉瘤S180、艾氏癌腹水型EAC和 L615白血病，目前L615往往以P388或 L1210小鼠白血病株取代。 • 我国对新药在第一轮筛选有效的基础上， 推荐人癌异种模型进行第二轮筛选，即人 癌进行T细胞免疫缺陷或免疫抑制裸鼠异 种移植模型。
• (3)瘤细胞悬液的制备：数个瘤块混合，剪成小
块，用玻璃组织匀浆器研磨，生理盐水适量稀释 成l：3或l：4的瘤细胞悬液。
• 1.1动物选择
• 常用小鼠、大鼠和地鼠。每批实验用同一性别（但乳癌、 卵巢癌、宫颈癌等必须用雌性）。
• 1.2肿瘤移植 • (1)一般要求 无菌、低温（消毒不严、瘤块污染常是接种失败的主
要原因）
接种部位: 皮下接种(右前肢腋);肌肉接种(大腿肌肉部);
腹水型接种(腹腔)。
• (2)瘤块制备：取接种7-10天、生长旺盛且无溃
• 【操作步骤】
（1）0.25%胰酶消化对数生长期细胞，5%～10%NBS的RPMI 1640调细胞浓度50000个/ml。96孔板100ul/孔。设溶剂 对照，每组 3-6 平行孔。 37 ℃， 5%CO2、95% 空气的培养 箱中预培养24h，弃上清。 （2）加药物5个10倍稀释的浓度（溶剂常用的有二甲亚砜 和水)，通常为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L。 （ 3 ）细胞连续培养 24 ～ 72h，每孔加入 10 μ l 5mg/ml 的 MTT溶液（以无血清培养基配制），继续培养4h。 （4）吸去上清。加入200μ l DMSO，轻轻振荡以使甲臜完 全溶解。570nm处用酶标仪测定OD值。 （5）计算抑制率(%)=（对照OD-药物OD）/对照OD*100%
抗肿瘤药物实验法
安徽医科大学临床药理研究所 2010.04.30
在抗肿瘤研究中，人们提出了肿瘤多步骤 、 DNA突变、细胞凋亡、细胞周期核心机制、细胞周 期启动及多条信号转导途径参与等许多理论和学说。 抗肿瘤药的研究随着理论的更新和技术的进步， 已从以核酸等为靶点的杀伤型细胞毒药转向对肿瘤 新靶点的研究。包括化学预防药、分化诱导剂、凋 亡诱导剂、信号传导阻滞剂、血管生成抑制剂、肿 瘤耐药逆转剂、生物调节剂以及化放疗保护剂等。 随着新型抗癌药的研究，诞生了许多抗肿瘤药物实 验方法。
（ 2 ）软琼脂集落形成：适用悬浮和贴壁生长细胞。
1）计数对数生长期细胞，15% NBS培养液配成1000个/ml细 胞悬液，37℃温育。 2）取33～35mm培养皿，3复皿，加受试药20μ l。 3）取37℃新鲜培养液9份，加沸水浴中融化的5%琼脂液1份， 摇匀，加入平皿，每个1ml，混匀置室温使琼脂凝固。 4）取预温的细胞悬液按每9.4ml加5%琼脂液0.6ml的比例混 匀，加入已铺底层琼脂的平皿中，每个1ml，置室温使琼 脂凝固。 5）将平皿置5%CO2，37℃孵育箱中培养7～10天。 6）镜下计数直径大于75μ m（50个细胞以上）的集落。
第1节 肿瘤细胞体外筛选方法
一、抗肿瘤药体外方法
动物模型在抗肿瘤药物的评价中起重要的 作用，但动物模型费用高，周期长使其不适 合大规模的抗肿瘤药物评价。因此抗肿瘤药 初步筛选首先应采用肿瘤细胞体外实验方法， 既节约成本又节省时间。
1.MTT法 【基本原理】活细胞线粒体中存在的脱氢酶能够 代谢还原黄色的溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2） -2，5-二苯基四氮唑（MTT）为蓝紫色的甲臜； 而死细胞此酶消失，MTT不被还原。 用DMSO溶解甲臜后，570nm处酶标仪测定其吸光 度（OD值）。 OD值与活细胞数成正比，因此可 根据 OD 值推测出活细胞的数目，了解药物抑制 或杀伤肿瘤细胞的能力。
【结果评定】
（1）剂量反应曲线：以集落抑制百分率与剂量对数作图， 可以得到一条S形曲线并求出药物的半数抑制浓度 （IC50）。 （2）亦可计算各加药组集落形成率。
5、癌细胞分化诱导实验
【基本原理】癌症属于细胞分化异常的疾病。恶性肿 瘤存在着明显的细胞分化受阻。白血病、黑色素瘤、 肝癌、结肠癌、神经母细胞瘤等可在体外被某些化合 物诱导分化为正常细胞或近似正常的细胞。这些发现 为抗肿瘤药物研究开辟了一条新的途径。因此，癌的 分化治疗已成为癌症研究的重要前沿方向之一。
肝癌Bel 7402细胞分化诱导实验 【基本原理】肝癌 Bel 7402 细胞甲胎蛋白（ AFP） 在肝癌中分泌量很高。 γ -GT （半乳糖转移酶） 在癌症发生发展过程中活性逐渐上升。白蛋白 （ALB）及TAT（酪氨酸转氨酶）在分化良好细 胞下降。在体外测定这些蛋白的含量及活性， 用以判断肝癌细胞的分化程度。 AFP及ALB测定 ：AFP、ALB放免测定试剂盒说明 测定AFP及ALB含量 γ -GT 、TAT测定：紫外可见分光光度法。
1.3 移植性动物肿瘤的质量鉴定 (1)每年进行一次实验动物瘤株的组织学检查。 (2) 接种前置37℃培养箱内以检查细菌，霉菌;在接 种和传代过程中，必须严格无菌操作，防止感染。 (3)肿瘤生长潜力的检查 1)实体瘤：若对照组中20％肿瘤<400mg或平均重量 <1g；大鼠肿瘤平均重量小于2g，作废。 2)腹水型肿瘤：对照组平均生存率应在规定范围内。
第2节 肿瘤动物模型体内筛选方法
1.诱发肿瘤动物模型实验法 2.自发肿瘤动物模型实验法 3.移植性肿瘤动物模型实验法 4. 转基因动物肿瘤实验法
• 对诱发肿瘤的评价
• 诱发性肿瘤的病因与由环境因素所诱致人癌情况相似。 癌细胞增殖动力学在两者间亦接近，故动物诱发肿瘤 类似人体肿瘤。 • 但人癌原因十分复杂，诱癌剂不清，肿瘤的病理组织 学与动物不同，发生发展与动物诱发肿瘤不完全一致。 • 诱发肿瘤不仅诱发需时较长，成癌率不高。多数内脏 肿瘤不作解剖，难以判断是否已发生肿瘤。发生时间 先后、发展速度个体差异大。 • 加之化学致癌物的来源比较困难，并随着环境保护意 识的增强对相关的动物实验室提出了更高的要求和限 止，所以本法不宜作一般抗癌药物筛选应用. • 对移植性肿瘤有效的药物，可用本法进一步验证其抗 癌疗效。
• 分化指标包括形态学变化、及生化功能变化 。
• • • • 人早幼粒细胞白血病HL-60细胞的分化诱导实验 HL-60细胞分化为成熟度不同的粒细胞或巨噬细胞 硝基四氮唑蓝（NBT）试验:NBT还原能力应大于50％。 形态学变化的观察:成熟粒细胞所占比例越高，说明分 化效果越好。 • 吞噬功能测定:分化诱导剂的吞噬百分率应在50％以上。
【注意事项】 （1）优点：XTT代谢产物溶解于水，不需要吸去 上清就可测OD值，简单方便，减少误差。 （2）XTT不易被线粒体酶还原，因此同时加入电 子偶联剂 (PMS)。 （3）每孔的XTT量不宜加入太多，高浓度的代谢 产物抑制线粒体酶活性。 （4）XTT和PMS现用现配。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ.染料排斥法检测药物对肿瘤细胞的生长抑 制
移植性肿瘤实验法
• 动物移植性肿瘤实验法是最通用的抗肿瘤方法， 比自发性、诱发性及转基因动物肿瘤容易造模, 成功率高（100％），且能同时获得大量生长 相对均匀肿瘤。 • 一般给药7-10天，第8-11天解剖动物。 • 观察指标：一般状况，体重变化及死亡率，判 断药物是否有明显的抑制肿瘤生长的作用，为 抗癌药物临床疗效提供有意义的依据。 • 动物移植性肿瘤是任何体外试验不能代替的。
• (4)腹水型肿瘤悬液的制备 1)抽取腹水：选择接种后7-10天瘤源动物，腹水 应为乳白色浓稠液体(如黄色或有大量红细胞则弃 去) 。 2)细胞计数：用白细胞计数法计瘤细胞总数。 3)接种：腹水用无菌生理盐水或含葡萄糖的平衡 盐水(如Hanks液、Gey液等)稀释至适当的浓度 （1×107 /ml ），ip每鼠0.2ml。 • (5)白细胞瘤株的接种：腹水型白细胞瘤如P388及 L1210的接种同腹水型肿瘤接种法。
2.XTT法 【基本原理】 XTT 是 MTT 的衍生物，经过 活细胞代谢还原成水溶性的代谢产物， 代谢产物的量与活细胞的数目成正比， 因此利用酶标仪在检测波长465nm处测定 代谢物的 OD 值可以推测活细胞的数量。 数据处理方法同MTT法。
• 【操作步骤】 （1）细胞接种，药物处理均同MTT方法。 （ 2 ）药物处理 24 ～ 72h 后，每孔加 50 μ l XTT 溶 液 （ 内 含 5 0 μ g XTT，5μ l 10mmol/L 的电子偶联剂 (PMS)）继续培 养4h。 （3）96 孔培养板振荡 2 ～ 3min 后，直接用 酶标仪在465nm波长处测OD值。
• 【操作步骤】
（1）贴壁集落形成：适用于几乎所有贴壁生长的细胞。 1）生长期贴壁细胞一瓶，胰蛋白酶消化成单细胞悬液， 活细胞计数，培养基稀释成50～100个细胞/ml。 2）取直径33～35mm培养皿（或15ml培养瓶）或6孔板， 每组3复孔/皿，受试药20μ l，稀释后细胞悬液2ml， 摇匀，5%CO2、37℃培养箱培养7～14天。 3）弃上清， PBS洗 2 次， 2ml/ 次，无水甲醇固定 5min， 静置干燥，用吉姆萨染色或1%结晶紫染色5～10min后， 用自来水冲洗，室温干燥，镜下计数75μ m以上的集落。
【基本原理】 活细胞有排斥染料（如伊红、台盼蓝、苯胺黑等 染色的能力，而细胞死亡后由于膜完整性遭到破 坏，细胞即被着色。
【操作步骤】 （1）25ml培养瓶中加入细胞4×104个、受试药40μ l， 终体积4ml， （2）5%CO2，37℃培养48～96h。 （3）取细胞悬液 0.4ml，加 0.4% 台盼蓝液 0.1ml，在室 温作用5min，在15min内，细胞计数板计数约200个细 胞中死细胞（蓝色）的个数。 【结果评定】 （1）活细胞率%=（未染色细胞数/细胞总数）×100%。 （2）将活细胞率与药物浓度的对数作图，可得到S形剂 量反应曲线，计算半数杀伤浓度（LC50）。 （3）当 LC50<10μ g/ml并能重复时，提示药物应进一步 实验。
对转基因小鼠肿瘤模型的评价 • 该模型较好地再现了人类肿瘤发生发展的完整 变化，包括机体从正常演变为癌前病变进而发 展为恶性肿瘤的全过程，该模型也为相关基因 与肿瘤的关系在整体水平研究和基因药物的研 发提供了良好的手段。 • 但肿瘤的发生受到一个或多个基因的协同调控 的，与转基因小鼠肿瘤模型不同； • 该模型同样存在实验周期长、肿瘤发生时间不 齐、繁育能力较低以及成本较高等缺点。
对自发肿瘤总的评价
• 其肿瘤发生率与瘤细胞动力学特点与人癌近似，生长 较移植肿瘤慢，对药物敏感度不高，疗程较长，故便 于进行综合化疗的研究； • 理论上用带有自发肿瘤模型筛选药物较理想。然而， 动物自发肿瘤的病因取决于的遗传特性，与人癌病因 区别较大。 • 很难在限定期间内得到大量生长均匀的带瘤动物，各 动物肿瘤之间生长速度差异也较大，给评价带来困难。 • 此类肿瘤常用于特殊目的试验或作为“二级筛选”模 型。
【注意事项】
药物杀伤细胞作用可能被低估原因： （ 1 ）存活细胞可能继续繁殖，使活细胞率增高。 （ 2 ）死细胞可能过早地崩解，计数时已不存在， 使死细胞率下降。
4. 集落形成法测定药物对肿瘤克隆原细胞的生 长抑制作用 【基本原理】克隆原细胞指具有持续增殖能力 的细胞。当单个细胞能连续分裂 6 代或以上时， 其后代所组成的群体（集落）含50个以上细胞。 计数集落可以对克隆原细胞作定量分析。反映 了单个细胞增殖潜力，能较灵敏地测定抗肿瘤 药物的活性，目前被认为是一种较理想的检测 方法。 常用的集落形成方法可分为贴壁法及半固体培 养基法。
• 一种药物未必对各种类型的移植性肿瘤有 效，选择某一瘤株供筛选都可能漏筛药物。 • 动物肿瘤的生物学特点与人类有较大的差 距，动物瘤株恶性程度高，生长迅速，对 药物的敏感性比人类自发的癌瘤高得多， 因此，对动物肿瘤生长有抑制的药物对人 癌不一定有效。本法的命中率低。
• 筛选药物时最好采用三种瘤株，即肉瘤、 腹水型肿瘤和白血病株肿瘤。 • 国内用肉瘤S180、艾氏癌腹水型EAC和 L615白血病，目前L615往往以P388或 L1210小鼠白血病株取代。 • 我国对新药在第一轮筛选有效的基础上， 推荐人癌异种模型进行第二轮筛选，即人 癌进行T细胞免疫缺陷或免疫抑制裸鼠异 种移植模型。