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连接，产生环状DNA片段；以环化产物为底物，用根据已知片段设计 的反向引物进行PCR扩增，从而得到含有未知片段的扩增产物 P-PCR 是由Jones等提出的利用末端反向重复序列与已知序列互补配 对形成环状单链模板，有效增强了引物与模板结合的特异性。反应需 要3个根据已知序列设计的引物，3个引物在已知序列内呈线性排列， 其中第3个引物可作为接头使用，可与已知序列互补配对形成锅柄状单 链模板。其过程为，首先酶切基因组DNA，产生5‘或3’粘末端，然后连 接上合适的接头(primer 3)，连接好后最好用核酸外切酶I除去多余的 接头，由于连接上的接头与已知序列是反向重复序列，变性后的DNA 单链可退火形成锅柄状单链模板，之后分别用3个单引物进行3次PCR 扩增，能有效地扩增2～9kbp的大片段未知序列 。
转录因子
由某一基因表达产生的蛋白质因 子，通过与另一基因的特异的顺式作 用元件相互作用，调节其表达。
这种调节作用称为反式作用。
还有的蛋白质因子可特异识别、 结合自身基因的调节序列，调节自身 基因的表达，称顺式作用。
DNA
a
mRNA 蛋白质A
C
A c
顺式调节
C
反式调节
A
b百度文库
DNA mRNA
蛋白质C
1 顺式作用元件（cis-acting element)
——可影响自身基因表达活性的DNA序列
转录起始点
DNA
RNA聚合酶Ⅱ
B
A
编码序列
DNA A
转录起始点
RNA聚合酶Ⅱ
mRNA B
mRNA
顺式作用元件
按功能特征，真核基因顺式作用元件分为：启动子 （promoter）、增强子（enhancer）、沉默子 （silencer ）
1.1 启动子
真核基因启动子是RNA聚合酶结合位点周围的一组转 录控制组件，至少包括一个转录起始点以及一个以上 的功能组件。位于转录起点附近，是促进DNA转录的 DNA序列，又称分子内作用元件，是DNA分子上可与 RNA聚合酶结合并使之转录的部位，但启动子本身不 被转录。
并非任何细胞型特异的蛋白在任何情况下都起作用，而是取决于核心 启动子提供一个合适的环境来决定基因是被激活还是被抑制。
构建多个启动子连接多个基因的表达载体，虽然可以实现同时转入多 个基因的愿望，但这种载体一方面构建困难，另一方面如果引入的启 动子之间仅仅有90bp 的同源性顺序，导入生物体内，就会引起所谓的 基因表达”共抑制”现象，而使基因沉默。因此，将极性启动子人工改 造为高效双向表达的启动子，对于促进基因工程的进展具有重要意义 。
根据启动子的转录模式可将其分为3类：组成型启动子、组织或器官特异 性启动子和诱导型启动子.
由两部分组成：
核心启动子（CPE)：指保证RNApolⅡ转录正常起始所必需的、最 少的DNA序列，包括转录起始位点及转录起始位点上游-25 ~ -30 bp 的TATA盒。它单独起作用时，只能确定转录起始位点并产生基础水 平的转录； 上游启动子元件（UPE)：包括通常位于-70bp附近的CAAT盒、GC 盒等，能通过TFⅡD复合物调节转录起始的频率，提高转录效率。
指真核生物基因组中含有可以调控自身基因表达活性的特异 DNA序列。
顺式作用元件能够被特异转录因子识别和结合，从而影响基 因表达活性。
顺式作用元件的作用是参与基因表达的调控，本身不编码任 何蛋白质, 仅仅提供一个作用位点, 要与反式作用因子相互作 用而起作用。
真核生物
顺式作用元件(cis-acting element)
载体质粒pZ16S，进行序列测定，结果表明所克隆的片段长为144bp
，含有SD序列。同源比较结果表明，所克隆的片段与水稻叶绿体
16SrRNA启动子序列具有100％的同源性。
环状PCR 环状PCR包括I-PCR(Inverse-PCR)和P-PCR(Panhandle-PCR)。这2
种PCR都是根据一端已知序列设计的嵌套式引物进行PCR。 I-PCR的实验程序包括，基因组DNA经酶切后用T4DNA连接酶进行自
利用启动子探针载体筛选启动子 利用启动子探针载体筛选启动子的过程为，先选用1种适当的限制性 核酸内切酶消化切割染色体DNA，然后将切割产生的DNA限制片段群 体与无启动子的探针质粒载体重组，并按照设计的要求使克隆的片段 恰好插在紧邻报告基因的上游位置；随后再把重组混合物转化给寄主 细胞，构建质粒载体基因文库，并检测报告基因的表达活性。
生物中有许多启动子，如E.coli约有2000个启动子。各启动子的效率可不相同， E.coli的强启动子每2秒钟启动一次转录，而弱启动子每10分钟才启动一次，从百 多个大肠杆菌启动子结构的分析，得知两个强启动子的同源序列的中心在转录起 始部位（基因编码链上第一个核苷酸） 5‘侧约10和35个核苷酸处，弱启动子序列 中往往有多处核苷酸被置换。
通过从一侧逐段缺失 来确定启动子的边界. 当一段缺失不会阻碍 RNA合成, 而下一段缺 失使转录不再发生时, 那么我们可以确定启 动子的边界必然存在
于两者之间.
启动子克隆的几种方法
启动子的克隆对于构建基因工程载体，表达目的蛋白有着重要的意义。启动子 克隆的方法很多，从常用的利用启动子探针型载体筛选启动子到PCR方法的应 用，此后相继问世的一些基于PCR法的克隆启动子技术，像I-PCR、P-PCR、 SSP．PCR、YADE、TAIL-PCR等，为克隆启动子提供了更可靠，更合理的方 法。
利用PCR技术克隆启动子
即根据发表的基因序列，设计引物，克隆基因的启动子，由于PCR法 简便快捷，近年来人们较多采用此方法克隆基因启动子。
苏宁等根据已报道的水稻叶绿体16SrRNA启动子基因序列设计5‘
启动子序列的引物，以水稻叶绿体DNA为模板，PCR扩增出16SrRNA
基因5’启动子区的片段，酶切克隆到pSK的SacI和SphI位点，构建测序
有研究表明，将单向极性植物表达启动子改造为能够双向表达的启动 子对于植物基因工程研究和应用具有不可估量的作用，其应用前景十 分广阔。
Promoter elements are defined by mutations and footprinting. 用突变法和印迹试验法确定启动子元件.
在合适的体外或体内检验系统中, 启动子 是根据其附着序列产生转录的能力来进行 定义的.
转录因子
由某一基因表达产生的蛋白质因 子，通过与另一基因的特异的顺式作 用元件相互作用，调节其表达。
这种调节作用称为反式作用。
还有的蛋白质因子可特异识别、 结合自身基因的调节序列，调节自身 基因的表达，称顺式作用。
DNA
a
mRNA 蛋白质A
C
A c
顺式调节
C
反式调节
A
b百度文库
DNA mRNA
蛋白质C
1 顺式作用元件（cis-acting element)
——可影响自身基因表达活性的DNA序列
转录起始点
DNA
RNA聚合酶Ⅱ
B
A
编码序列
DNA A
转录起始点
RNA聚合酶Ⅱ
mRNA B
mRNA
顺式作用元件
按功能特征，真核基因顺式作用元件分为：启动子 （promoter）、增强子（enhancer）、沉默子 （silencer ）
1.1 启动子
真核基因启动子是RNA聚合酶结合位点周围的一组转 录控制组件，至少包括一个转录起始点以及一个以上 的功能组件。位于转录起点附近，是促进DNA转录的 DNA序列，又称分子内作用元件，是DNA分子上可与 RNA聚合酶结合并使之转录的部位，但启动子本身不 被转录。
并非任何细胞型特异的蛋白在任何情况下都起作用，而是取决于核心 启动子提供一个合适的环境来决定基因是被激活还是被抑制。
构建多个启动子连接多个基因的表达载体，虽然可以实现同时转入多 个基因的愿望，但这种载体一方面构建困难，另一方面如果引入的启 动子之间仅仅有90bp 的同源性顺序，导入生物体内，就会引起所谓的 基因表达”共抑制”现象，而使基因沉默。因此，将极性启动子人工改 造为高效双向表达的启动子，对于促进基因工程的进展具有重要意义 。
根据启动子的转录模式可将其分为3类：组成型启动子、组织或器官特异 性启动子和诱导型启动子.
由两部分组成：
核心启动子（CPE)：指保证RNApolⅡ转录正常起始所必需的、最 少的DNA序列，包括转录起始位点及转录起始位点上游-25 ~ -30 bp 的TATA盒。它单独起作用时，只能确定转录起始位点并产生基础水 平的转录； 上游启动子元件（UPE)：包括通常位于-70bp附近的CAAT盒、GC 盒等，能通过TFⅡD复合物调节转录起始的频率，提高转录效率。
指真核生物基因组中含有可以调控自身基因表达活性的特异 DNA序列。
顺式作用元件能够被特异转录因子识别和结合，从而影响基 因表达活性。
顺式作用元件的作用是参与基因表达的调控，本身不编码任 何蛋白质, 仅仅提供一个作用位点, 要与反式作用因子相互作 用而起作用。
真核生物
顺式作用元件(cis-acting element)
载体质粒pZ16S，进行序列测定，结果表明所克隆的片段长为144bp
，含有SD序列。同源比较结果表明，所克隆的片段与水稻叶绿体
16SrRNA启动子序列具有100％的同源性。
环状PCR 环状PCR包括I-PCR(Inverse-PCR)和P-PCR(Panhandle-PCR)。这2
种PCR都是根据一端已知序列设计的嵌套式引物进行PCR。 I-PCR的实验程序包括，基因组DNA经酶切后用T4DNA连接酶进行自
利用启动子探针载体筛选启动子 利用启动子探针载体筛选启动子的过程为，先选用1种适当的限制性 核酸内切酶消化切割染色体DNA，然后将切割产生的DNA限制片段群 体与无启动子的探针质粒载体重组，并按照设计的要求使克隆的片段 恰好插在紧邻报告基因的上游位置；随后再把重组混合物转化给寄主 细胞，构建质粒载体基因文库，并检测报告基因的表达活性。
生物中有许多启动子，如E.coli约有2000个启动子。各启动子的效率可不相同， E.coli的强启动子每2秒钟启动一次转录，而弱启动子每10分钟才启动一次，从百 多个大肠杆菌启动子结构的分析，得知两个强启动子的同源序列的中心在转录起 始部位（基因编码链上第一个核苷酸） 5‘侧约10和35个核苷酸处，弱启动子序列 中往往有多处核苷酸被置换。
通过从一侧逐段缺失 来确定启动子的边界. 当一段缺失不会阻碍 RNA合成, 而下一段缺 失使转录不再发生时, 那么我们可以确定启 动子的边界必然存在
于两者之间.
启动子克隆的几种方法
启动子的克隆对于构建基因工程载体，表达目的蛋白有着重要的意义。启动子 克隆的方法很多，从常用的利用启动子探针型载体筛选启动子到PCR方法的应 用，此后相继问世的一些基于PCR法的克隆启动子技术，像I-PCR、P-PCR、 SSP．PCR、YADE、TAIL-PCR等，为克隆启动子提供了更可靠，更合理的方 法。
利用PCR技术克隆启动子
即根据发表的基因序列，设计引物，克隆基因的启动子，由于PCR法 简便快捷，近年来人们较多采用此方法克隆基因启动子。
苏宁等根据已报道的水稻叶绿体16SrRNA启动子基因序列设计5‘
启动子序列的引物，以水稻叶绿体DNA为模板，PCR扩增出16SrRNA
基因5’启动子区的片段，酶切克隆到pSK的SacI和SphI位点，构建测序
有研究表明，将单向极性植物表达启动子改造为能够双向表达的启动 子对于植物基因工程研究和应用具有不可估量的作用，其应用前景十 分广阔。
Promoter elements are defined by mutations and footprinting. 用突变法和印迹试验法确定启动子元件.
在合适的体外或体内检验系统中, 启动子 是根据其附着序列产生转录的能力来进行 定义的.