蛋白分离纯化操作及策略
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2
M 170 130 95 72 55 43 35 26 17 10 1 2 3 4 5 6 7 8
M：蛋白预染分子量标 准 1：超滤后的酵母培养 液上清 2：层析穿透液 3,6,7,8：分步洗脱2、5 、6、7号蛋白峰 4,5：0.5mol/L NaCl洗 脱含有HPS蛋白的层析 峰
Separation of CHT fraction on High Q
工艺策略
样品准备
技术手段：超声破碎、高压匀浆、组织匀浆、溶菌酶、离 心，沉淀（硫酸铵、等电点、有机溶剂），过滤，超滤
Baidu Nhomakorabea
包涵体表达的样品：菌液分离，包涵体提取和清洗，包 涵体溶解，复性 细胞周质表达的样品：菌液分离，反渗透破菌，沉淀和 超滤分离 细胞和酵母等真核分泌表达的样品：菌液分离，超滤或 直接捕获纯化 天然生物材料样品纯化未知蛋白质：不同来源样品处理 方法不同：
菌液分离，澄清
脱盐
离子交换
层析介质 颗粒大小 80－120um
捕获
亲和
CHT羟基磷灰石
中间纯化
精纯
疏水 亲和 离子交换 凝胶过滤（分子筛） 亲和
40－80um
10－50um
浓缩
工艺路线选择
Affinity——IEX——CHT
纯化mAb
• 原理 • Protein A to remove the bulk of HCP, DNA, endotoxin, virus. • UNOsphere Q to remove retrovirus, polish DNA, endotoxin, and HCP. • CHT to remove leached protein A and IgG aggregates, polish other contaminants.
基因工程下游分离已知蛋白
分子生物学实验室分离已知蛋白
蛋白质纯化一般步骤
1. 样品准备
2. 捕获
3. 中间纯化 4. 精纯
蛋白质纯化策略
层析的目标
• 目标
– – – – 纯度，Purity (>90% vs. ≥ 99.9%) 活性，Activity (active vs. inactive) 含量，Quantity (ng or mg levels) 关键杂质的对数减少，Log reductions of key contaminants
Before Starting…
纯度
• 必须了解的蛋白特性
– 分子量与等电点 – pH、温度稳定性，pH, temp stability – 盐、去污剂、有机溶剂和金属离子的影响 Effects of salt, detergents, organic solvents, metal ions – 翻译后修饰，Post-translational modifications
许望翔 军事医学科学院放射医学研究所
M 1 2 3 4 5 6
2
10000 9000 8000 7000
175 83 66 48 35
17 7
灰度值
25
6000 5000 4000 3000 2000 1000 0
1
M：蛋白预染分子量标准 1-5：诱导1-5天X蛋白表达条带 6：空载体诱导表达条带
2
2
Recovery table of purification steps
纯化步骤 总蛋白浓度 纯度 回收率
2
酵母发酵上清液
中空纤维柱超滤
0.1mg/ml
0.5mg/ml
8.5%
14%
100%
60%
羟基磷灰石层析 CHT
阴离子交换层析High Q P-6 DG柱脱盐 总回收率
0.3mg/ml
0.4mg/ml 0.3mg/ml
蛋白质分离纯化策略
蛋白质分离纯化策略
生化学家分离未知蛋白
规模较小，目标蛋白含量往往极低 各步骤用活性分析和蛋白物理化学分析严密监控 针对性强，过程复杂 产物纯度要求高，往往用户测序 规模较大，目标产物含量较高 重视纯化过程的技术经济指标 有较强的针对性 产物纯度要求高，通常有特殊的要求 规模小 目标产物含量较高，往往高表达产物，大于5％ 纯度和回收率往往要求较低，电泳纯 方法比较简单，往往在2步以内，亲和层析是最常用的手段 硬件结构有通用性
各种微生物发酵液和细胞培养液、动物天然样品（蛇毒、蟾 毒、昆虫）、植物天然样品等等
工艺策略
• 捕获: 快速去除关键杂质，例如能降解目标蛋白的组分，如蛋白酶等，浓
缩样品，去除高峰度杂质蛋白
• 中间纯化: 去除大部分残留的杂质蛋白
• 精细纯化： 去除与目标蛋白性质接近的残留少量或微量杂质蛋白
工艺策略
1
工艺路线选择
Affinity——IEX——CHT
纯化mAb
Protein A UNOsphere Q
1
2 3
1
2
3
S 0 1 2
4
CHT
HPSEC
Bio-Silect SEC 400-5 50mM Hepes 0.5M NaCl 2M urea, pH 7
4
5
5
4
Expression of the Yeast recombinant protein X
3 天数
4
5
Separation on CHT Type I
2
前期，我们通过先后运用0-1mol/L NaCl梯度和5-500mmol/L Na3PO4的盐梯度进行双梯度 洗脱，发现X蛋白能够在大于0.4mol/L NaCl浓度下被完全洗脱下来（结果未给出）。
SDS-PAGE analysis of CHT separation fractions
23%
91% 91%
50%
60% 80% 14.4%
2
SDS-PAGE analysis of High Q fractions
2
M 1 2 3 4 5
170 130 95 72 55
43
35 26
M：蛋白预染分子量标 准 1：羟基磷灰石层析收 集峰 2,3：层析穿透液 4：洗脱的HPS蛋白峰 （2号峰） 5：3号洗脱峰
17
Desalting using lab-made P6 column
• 选择层析类型
– 技术类型 – 变性/非变性，Denaturing/non-denaturing – 分辨率，Resolution – 得率，Yield – 速度，Speed
得率 时间
活性
工艺策略
各步骤的评价参数
纯度 得率 生物活性 工艺时间
各步骤的评价方法
电泳：SDS-PAGE，PAGE 蛋白质浓度测定 生物活性测定
M 170 130 95 72 55 43 35 26 17 10 1 2 3 4 5 6 7 8
M：蛋白预染分子量标 准 1：超滤后的酵母培养 液上清 2：层析穿透液 3,6,7,8：分步洗脱2、5 、6、7号蛋白峰 4,5：0.5mol/L NaCl洗 脱含有HPS蛋白的层析 峰
Separation of CHT fraction on High Q
工艺策略
样品准备
技术手段：超声破碎、高压匀浆、组织匀浆、溶菌酶、离 心，沉淀（硫酸铵、等电点、有机溶剂），过滤，超滤
Baidu Nhomakorabea
包涵体表达的样品：菌液分离，包涵体提取和清洗，包 涵体溶解，复性 细胞周质表达的样品：菌液分离，反渗透破菌，沉淀和 超滤分离 细胞和酵母等真核分泌表达的样品：菌液分离，超滤或 直接捕获纯化 天然生物材料样品纯化未知蛋白质：不同来源样品处理 方法不同：
菌液分离，澄清
脱盐
离子交换
层析介质 颗粒大小 80－120um
捕获
亲和
CHT羟基磷灰石
中间纯化
精纯
疏水 亲和 离子交换 凝胶过滤（分子筛） 亲和
40－80um
10－50um
浓缩
工艺路线选择
Affinity——IEX——CHT
纯化mAb
• 原理 • Protein A to remove the bulk of HCP, DNA, endotoxin, virus. • UNOsphere Q to remove retrovirus, polish DNA, endotoxin, and HCP. • CHT to remove leached protein A and IgG aggregates, polish other contaminants.
基因工程下游分离已知蛋白
分子生物学实验室分离已知蛋白
蛋白质纯化一般步骤
1. 样品准备
2. 捕获
3. 中间纯化 4. 精纯
蛋白质纯化策略
层析的目标
• 目标
– – – – 纯度，Purity (>90% vs. ≥ 99.9%) 活性，Activity (active vs. inactive) 含量，Quantity (ng or mg levels) 关键杂质的对数减少，Log reductions of key contaminants
Before Starting…
纯度
• 必须了解的蛋白特性
– 分子量与等电点 – pH、温度稳定性，pH, temp stability – 盐、去污剂、有机溶剂和金属离子的影响 Effects of salt, detergents, organic solvents, metal ions – 翻译后修饰，Post-translational modifications
许望翔 军事医学科学院放射医学研究所
M 1 2 3 4 5 6
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10000 9000 8000 7000
175 83 66 48 35
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灰度值
25
6000 5000 4000 3000 2000 1000 0
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M：蛋白预染分子量标准 1-5：诱导1-5天X蛋白表达条带 6：空载体诱导表达条带
2
2
Recovery table of purification steps
纯化步骤 总蛋白浓度 纯度 回收率
2
酵母发酵上清液
中空纤维柱超滤
0.1mg/ml
0.5mg/ml
8.5%
14%
100%
60%
羟基磷灰石层析 CHT
阴离子交换层析High Q P-6 DG柱脱盐 总回收率
0.3mg/ml
0.4mg/ml 0.3mg/ml
蛋白质分离纯化策略
蛋白质分离纯化策略
生化学家分离未知蛋白
规模较小，目标蛋白含量往往极低 各步骤用活性分析和蛋白物理化学分析严密监控 针对性强，过程复杂 产物纯度要求高，往往用户测序 规模较大，目标产物含量较高 重视纯化过程的技术经济指标 有较强的针对性 产物纯度要求高，通常有特殊的要求 规模小 目标产物含量较高，往往高表达产物，大于5％ 纯度和回收率往往要求较低，电泳纯 方法比较简单，往往在2步以内，亲和层析是最常用的手段 硬件结构有通用性
各种微生物发酵液和细胞培养液、动物天然样品（蛇毒、蟾 毒、昆虫）、植物天然样品等等
工艺策略
• 捕获: 快速去除关键杂质，例如能降解目标蛋白的组分，如蛋白酶等，浓
缩样品，去除高峰度杂质蛋白
• 中间纯化: 去除大部分残留的杂质蛋白
• 精细纯化： 去除与目标蛋白性质接近的残留少量或微量杂质蛋白
工艺策略
1
工艺路线选择
Affinity——IEX——CHT
纯化mAb
Protein A UNOsphere Q
1
2 3
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S 0 1 2
4
CHT
HPSEC
Bio-Silect SEC 400-5 50mM Hepes 0.5M NaCl 2M urea, pH 7
4
5
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Expression of the Yeast recombinant protein X
3 天数
4
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Separation on CHT Type I
2
前期，我们通过先后运用0-1mol/L NaCl梯度和5-500mmol/L Na3PO4的盐梯度进行双梯度 洗脱，发现X蛋白能够在大于0.4mol/L NaCl浓度下被完全洗脱下来（结果未给出）。
SDS-PAGE analysis of CHT separation fractions
23%
91% 91%
50%
60% 80% 14.4%
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SDS-PAGE analysis of High Q fractions
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M 1 2 3 4 5
170 130 95 72 55
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35 26
M：蛋白预染分子量标 准 1：羟基磷灰石层析收 集峰 2,3：层析穿透液 4：洗脱的HPS蛋白峰 （2号峰） 5：3号洗脱峰
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Desalting using lab-made P6 column
• 选择层析类型
– 技术类型 – 变性/非变性，Denaturing/non-denaturing – 分辨率，Resolution – 得率，Yield – 速度，Speed
得率 时间
活性
工艺策略
各步骤的评价参数
纯度 得率 生物活性 工艺时间
各步骤的评价方法
电泳：SDS-PAGE，PAGE 蛋白质浓度测定 生物活性测定