基因工程和基因组学

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限制酶
连接酶
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❖ 反转录酶（reverse transcriptase） 这类酶来自于反转录病毒，它可以ＲＮＡ 为模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有 禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反转录 酶两种。
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三、载体（vector）
DNA重组：
不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键连接而形
成重新组合的DNA分子的过程，称为DNA重
组（DNA recombination）。
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基因工程概述
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基因工程概述
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工具酶
限制性内切核酸酶
DNA聚合酶Ⅰ
（Klenow片段）
逆转录酶
修饰酶
T4DNA连接酶 碱性磷酸酶
程。
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基因工程的基本过程： 目的基因的制备 载体的制备 目的基因与载体的连接 重组DNA分子导入宿主细胞 含目的基因细胞的筛选和鉴定
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基因工程（gene engineering）也称为遗传工 程（genetic engineering）、基因操作（gene manipulation）、ＤＮＡ重组技术 （recombination DNA techniques）。有时 人们还称它为基因克隆（gene cloning）或分子 克隆（molecular cloning）。
第九章 基因工程和基因组学
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第一节 基因工程
一、基因工程概述
基因工程的概念：
按照既定的目的和方案，把目的基因片段
与载体DNA连接形成重组DNA分子，然
后将其导入宿主细胞，并对含有目的基因
的细胞进行克隆，最后利用克隆的基因表
达、制备蛋白质或多肽，或定向改造细胞
乃至生物个体。这种技术方法称为基因工
（一）质粒（plasmid）
概念：质粒是细菌细胞内携带的染色体外的能独 立进行复制的环状DNA分子。
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具有以下特点（例如pUC18质粒） ①分子量小(2.69kb),也可以接受较大的外源片段. ②拷贝数多,在每个宿主细胞的拷贝数可达500个; ③多克隆位点多,克隆方便; ④具有α-互补显色表型,可作为检测重组质粒存在与否的 选择标记. α-互补：是指来自细菌DNA的lacZ酶(β-半乳糖苷酶)N端 的一段氨基酸残基(α-肽),在与α-肽缺失的酶混合后(体外 或体内),能恢复lacZ酶的活性的一种基因内互补现象.
末端脱氧核苷酰转移酶
Taq DNA聚合酶和其它
耐热DNA聚合酶
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二 限制性内切核酸酶
1、限制性内切核酸酶的命名： 命名规则： 用来源细菌的英文缩写斜体符号命名。它的第一 个字母大写，代表细菌的属名；第二、三字母小 写，代表细菌的种名；第四个字母代表菌株；最 后用罗马字母表示同一菌株中不同限制酶的编号。
克隆载体 载 体
表达载体
质粒 噬菌体 粘性质粒 M13噬菌体
大肠杆菌表载体 酵母菌表达载体 哺乳动物表达载体
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载体需要具备以下4个条件:
①具复制原点(ori),在宿主细胞中不仅能独立地自我 复制,而且能带动携带的外源DNA片段一起复制. ②具有多个克隆位点(multiple cloning site,MCS, 或称polylinker region),即具有多种限制性酶的切 点,而每一种酶的切点只有一个,用于克隆外源DNA 片段.这些酶切位点不存在于复制原点或抗性选择标 记基因内,以保持载体的自主复制特性及表型标记性 状. ③至少具有一个选择标记基因,这个基因通常是抗菌 素的抗性基因或某种酶的基因,而宿主细胞则没有这 种基因,使有或无载体的建筑宿精选主课件细胞具有易鉴别的表型2.4 ④易从宿主细胞中回收.
5’—GAATTC—3’ 3’—CTTAAG—5’
5’—GAATTC—3’ 3’—CTTAAG—5’
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❖ 3、切割方式：
❖ 交错切割DNA 双链,产生两个相同的单链黏性末 端(sticky end)；平齐切割DNA 双链,产生两个 相同的单链平齐末端。
❖ 例如：
5’—GAATTC—3’ 3’—CTTAAG—5’
5’—GAATTC—3’ 3’—CTTAAG—5’
5‘—G 3’—CTTAA
5’--AATTC—3’ G—5’
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❖
5’--CCCGGG—3’
❖
3’—GGGCCC—5’
❖
5’--CCC GGG—3’
❖
3’—GGG CCC—5’
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❖ 末端转移酶（terminal transferase） 称为末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase），它所催化的 反应与DNA pol I 相似，所不同的是它不需要模 板，它可以含有３’－ＯＨ的ＤＮＡ片段为引物， 在３’－ＯＨ端加入核苷酸达几百个。末端转移 酶常用于在平头ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸， 从而形成粘性末端。
切割DNA，切割位点难以预测。每隔一段DNA
序列随机切断双连DNA分子,没有序列特异性.
Ⅱ限制酶：在识别位点切割DNA，切割位点固定，
序列可知。
Ⅲ限制酶：在识别位点附近切割DNA，切割位点
难以预测。
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第Ⅱ类限制性酶能识别一段特异的DNA序列,准确
地酶切双链DNA的特异序列（回纹对称序列）. 从两个方向阅读序列相同的序列称为回纹对称序列
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名称 EcoR Ⅰ Hind Ⅲ HindⅡ HpaⅠ
属名
种名
株名 序号
菌株来
E
co
R
Ⅰ
Escherichi
H
in
H
in
H
pa
d
Ⅲ
Haemophi
influenzae
d
Ⅱ
Haemophi
influenzae
/
Ⅰ
Haemophi
fluenzae
2、限制性酶分类.
Ⅰ限制酶：通常在识别位点下游100~1000bp处
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❖ ＤＮＡ连接酶（DNA ligase）该酶常从Ｔ４噬 菌体的受感细胞中提取，是由Ｔ４噬菌体基因组 所编码的，所以基因工程中常用的连接酶是Ｔ４ 连接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂键的形成， 从而使两个片段以共价键的形式结合起来。
❖ DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子能很好 地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接， 但连接效率较低，必须加大酶的用量。