胡萝卜素和叶黄素的提取方法

分光光度法

A 装置

A.a 色谱柱

内径12.5mm，长30cm的硬质玻璃管，下端内径2mm，长约10cm的毛细管伸到25ml容量瓶的颈部。

A.b 真空过滤装置

用于收集洗脱液于容量瓶内。该装置经橡皮塞与色谱柱相连。

B 试剂

B.a 丙酮

无水，不含醇。在约10目锌粒存在下蒸馏得到。

B.b 已烷

市售品。

B.c 提取剂

已烷-丙酮-无水乙醇-甲苯(10+7+6+7)。

B.d 吸附剂Ⅰ

硅胶G和硅藻土按1+1(w/w)于机械混料机中混合1－2h。

B.e 吸附剂Ⅱ

活性氧化镁和硅藻土按1+1(w/w)于机械混料机中混合1－2h。

B.f 氢氧化钾甲醇溶液

40%溶解40g氢氧化钾于甲醇中，冷却后用甲醇稀释至100ml。

B.g 硫酸钠溶液

10%。溶解10g无水硫酸钠于100ml水中。

B.h 洗脱液

B.h.1

胡萝卜素-已烷-丙酮(96+4)溶液。

B.h.2

一羟基色素〔MHP〕-已烷丙酮(90+10)溶液。

B.h.3

二羟基色素〔DHP〕-已烷-丙酮〔80+20)溶液。

B.h.4

总叶黄色〔TX〕-已烷-丙酮-甲醇(80+10+10)溶液。

B.i 1-苯偶氮基-2-萘酚(

C.I.溶剂黄14；苏丹I)标准溶液

B.i.1 贮备液

1.0mM。用热无水乙醇重结晶标准品，并在70℃真空干燥箱中干燥至恒重。溶解0.1241g结晶于500ml丙酮-异丙醇(1+1)中。

B.i.2 工作液

0.04mM。用丙酮-异丙醇(1+1)稀释20ml贮备液至500ml，在暗处保存。

C 样品制备

将样品磨碎，过40目筛。准确称取适量样品〔2g玉米麸质或苜蓿粉；50mg金盏花粉；4g混合饲料〕于100ml容量瓶中，用移液管加入30ml提取液，密塞，旋转振摇1min。对于湿度较低的样品，如金盏花，脱水苜蓿或玉米麸质〔未经空气干燥〕，以1ml水/2g样品的比例加水到烧瓶中，密塞，旋转振摇1min。对于高湿度〔经空气干燥〕样品，可省去加水。

C.a 热皂化

〔用于快速提取和含叶黄素酯的样品〕。用移液管加2ml〔4g混合饲料加4ml〕40%的氢氧化钾甲醇液至烧瓶中，旋转振摇1min，然后将烧瓶置于56℃水浴上加热20min，接上空气冷凝管或冷却烧瓶颈部，以防止溶剂损失。冷却样品，于暗处放置1h。吸取30ml已烷至烧瓶中，旋转振摇1min，用10%Na2SO4溶液稀释至刻度，剧烈振摇1min。色谱分离前于暗处放置1h。上层液体积为50ml。

C.b 冷却〔过夜〕皂化

〔用于快速提取和含叶黄素酯的样品〕。用移液管加2ml〔4g混合饲料加4ml〕40%的氢氧化钾甲醇液至烧瓶中，旋转振摇1min，然后将烧瓶置于56℃水浴上加热20min，接上空气冷凝管或冷却烧瓶颈部，以防止溶剂损失。冷却样品，于暗处放置1h。吸取30ml已烷至烧瓶中，旋转振摇1min，用10%Na2SO4溶液稀释至刻度，剧烈振摇1min。色谱分离前于暗处放置1h。上层液体积为50ml。

D 色谱法

将色谱柱置于过滤器上，并于其底部塞入少许脱脂棉或玻璃棉。装入约12cm高的吸附剂Ⅰ，抽真空，补加吸附剂，使高达7cm，用平头器具如倒置的玻棒上的软木塞轻压吸附剂并平整表面，然后在吸附剂上面装入2cm高的无水Na2SO4，并将其压紧。

D.a 总胡萝卜素

D.b 叶黄素分离

D.b.1

将25ml容量瓶置于过滤装置中，给色谱柱施以真空，使洗脱液液面接近吸附剂表面，然后立即加入MHP洗脱液，一羟基色素〔玉米黄质，隐黄质〕和留在色谱柱内的任何单酯或双酯的谱带应比其它谱带先移至柱下方。当MHP的谱带全部洗脱，取下容量瓶置于暗处，达到室温后，用MHP洗脱液稀释至刻度，并测定其吸光度A。

D.b.2

将25ml容量瓶置于过滤装置中，给色谱柱施以真空，使洗脱液液面接近吸附剂表面，然后立即加入MHP洗脱液，一羟基色素〔玉米黄质，隐黄质〕和留在色谱柱内的任何单酯或双酯的谱带应比其它谱带先移至柱下方。当MHP的谱带全部洗脱，取下容量瓶置于暗处，达到室温后，

用MHP洗脱液稀释至刻度，并测定其吸光度A。

D.c 总叶黄素

如要测定总叶黄素量，则从原提取液的上液层吸取一定量新鲜溶液，加到装有7cm高吸附剂Ⅱ的色谱柱中，以已烷-丙酮(90+10)洗脱胡萝卜素，以已烷-丙酮-甲醇(80+10+10)洗脱总叶黄素。

E 测定

迅速测定溶液的吸光度A，以使异构化和自氧化带来的损失减少到最小。首先，以标准工作溶液有469－479nm间每间隔1nm检查校准分光光度计。若最大值不在474nm，应重校准仪器。当仪器显示吸光度A的最大值是在474nm，而狭缝的宽度为0.03，则工作溶液的读数应是0.561〔474〕和0.460(436)。仪器的偏离因子可通过下面的方程式进行校正。假如仪器无可控的狭缝，则假定(1)(2)染料标准工作溶液的吸光度A与胡萝卜素2.35mg/L在436nm及叶黄素2.38mg/L在474nm下的吸光度A相同。以便估算浓度。$$于436nm下测定胡萝卜素组分的吸光度A，474nm 下测定MHP和DHP组分的吸光度A。应控制洗脱液体积，使所测得的吸光度A在0.25和0.75之间，以提高测定的准确度。

F 计算

下列方程式适用于校准过的分光光度计在窄狭缝宽度下测得的吸光度A，196和236分别为规定波长下全反β-胡萝卜素和全反叶黄素的α值；b为比色池长度(cm)，d为稀释系数＝〔样品克数×加于色谱柱的提取液毫升数〕/〔50ml上液层×最终稀释体积毫升数〕；f为仪器偏离因子＝0.460/A^^436^^或0.561/A^^474^^。〔A^^436^^和A^^474^^均为观察值。〕$$胡萝卜素组分浓度(mg/lb)＝〔A^^436^^×454×f〕/(196×b×d)$$MHP组分浓度(mg/lb)，或DHP组分浓度(mg/lb)或总叶黄素浓度(mg/lb)＝〔A474×454×f〕/〔236×b×d〕