江南大学微生物研究生复试内容

2005微生物实验操作复试

1有哪些方法可以提高显微镜的分辨率？

答：显微镜的分辨率（Resolving power ）是指显微镜将样品上相互接近的两点清晰分辨出来的能力。其用镜头所能分辨出的两点间的最小距离表示，距离越小，分辨能力越好。可用公式表示：

A

N D .21λ= 物镜的数值口径（Numberical aperture ），简写为（N.A ）：表示从聚光镜发出的锥形光柱照射在观察标本上，能被物镜所聚集的量。可用公式表示：

θsin .n A N =

n ——标本和物镜之间介质的折射率

θ——由光源投射到透镜上的光线和光轴之间的最大夹角

可见物镜的分辨率是由物镜的NA 值与照明光源的波长两个因素决定。NA 值越大，照明光线波长越短，则D 值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即减小D 值，可采取以下措施:

（1） 降低波长λ值，使用短波长光源。（2）增大介质n 值以提高NA 值（NA=nsinu/2）。（3） 增大孔径角θ值以提高NA 值。（4） 增加明暗反差。

2革兰氏染色的步骤？哪几步最为关键？

答：（1）1、细菌的活化：将细菌接种营养琼脂斜面，培养16-24h 。

2、制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。

3、初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色1min 后，用水洗去剩余染料。

4、媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min ，水洗。

5、脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，直接用95%乙醇从载玻片上端冲洗脱色，直到流下的酒精无明显紫色时，立即水洗。

6、复染：滴加番红液，染色2min ，水洗

7、用滤纸吸干，油镜镜检。

（2）脱色是革兰氏染色中最为关键的步骤，其中乙醇的浓度，用量及涂片厚度都会影响脱色速度，最终影响观察效果。如果脱色过度，有可能会使革兰氏阳性菌呈假阴性；如果脱色不够，有可能使革兰氏阴性菌呈假阳性

3涂片染色前为什么要先进行固定？固定时应注意什么问题？

答：1）杀死微生物，固定细胞结构。

2）保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本被水冲洗掉。

3）改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比活的原生质易于染色。

注意问题：温度以载玻片接触手背，手背不觉得烫为宜，防止出现变形细胞；注意在通过火焰时，涂有细菌的一面向上。

4同一酵母菌培养液用血球计数板和平板菌落计数法同时计数，所得结果是否一样？为什么？进一步比较两种计数法的优缺点？

答：所得结果不一样。血球计数板记得的菌体数是活菌体和死菌体的总和，而平板菌落计数法记得的是活菌体的量。

血球计数板优点是直观、快速，方便，但该法计数的是样品中的总菌落数，无法计数活菌数。平板菌落计数法的优点是能粗出样品中的活菌数，缺点是手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。

5如何测定水中的大肠菌群数？测定水中大肠菌群数有什么实际意义？

答：大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。检测大肠菌群的方法有稀释培养法和膜滤法两种，其中稀释培养法是标准分析方法，包括处发酵试验、平板分离和复发酵试验三部分。具体方法为①采样、②处发酵试验③在指示性培养基上分离培养，④革兰氏染色及镜检，⑤复发酵试验，⑥结果。

检测意义：水中的病原菌多数来源于病人和病畜的粪便，由于病原菌的数量少，检测过程复杂，因此，直接测它们的存在非常困难。由于大肠杆菌在粪便中数量大，在体外存活时间与肠道致病菌相近，而且检测方法比较简便，因此采用测定大肠菌群或大肠杆菌的数量来作为水被粪便污染的标志。如果水中大肠菌群菌数超过一定数

量，则说明此水已被粪便污染，肯能还有病原菌。

6高压蒸汽灭菌的基本原理以及步骤

答：高压蒸汽灭菌是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内，在一定压力下保持15-30分钟进行灭菌。将待灭菌的物品放在一个密闭的加压锅内，通过加热，是灭菌锅内夹套间的水沸腾而产生蒸汽，待水蒸气急剧的将锅内冷空气从排气阀中排尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内压力，从而使沸点增高，获得高于100°C的温度，导致菌体蛋白凝固变性而达到灭菌的目的。

具体步骤：①.加水②装料③加盖④排气⑤升压⑥保压⑦降压⑧无菌检查

7如何制备大肠杆菌感受态细胞？

答：感受态细胞就是细菌最容易实现转化的状态。感受态细胞可以通过理化因素诱导产生，其中制备大肠杆菌感受态最常用的方法是CaCl2法。将细胞置于0℃的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞会膨胀成球形，细胞膜的通透性会发生改变。此外还可以应用PEG法和电击法，其中电击法可以实现大肠杆菌较高效率的转化。

步骤：1、挑取大肠杆菌新鲜菌落于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

2、取0.2ml培养液于含50mlLB培养液的三角瓶中，37℃震荡培养至OD值为0.3-0.4，于冰水中迅速冷却。

3、菌液置预冷的离心管中冰浴15min，于4℃，4000r/min离心5min，弃去上清液，加入预冷MgCl2-CaCl2溶液20ml，于冰水中放置15min。

4、于4℃，4000r/min离心5min，弃去上清液，用预冷CaCl2溶液2ml悬浮菌体。于冰水中放置15min，分装至离心管中，每管200ul。

8简述移液管和培养皿的包扎注意事项

答：1、培养皿：包扎前洗净烘干，包扎时每10套迭在一起，用牛皮纸包扎后再用绳子捆扎，防止分散开。

2、移液管：包扎前洗净烘干，在孔吸的一端塞入少许脱脂棉，防止菌体误吸入口中及口中的微生物吸入管而进入培养物造成污染，塞入棉花量要适宜，不宜露在管口外面；包扎时，卷纸成45°卷起，并包扎好，以防散开。

9 NTG诱变的机理以及诱变的步骤。简述每一步操作的理由

答：NTG为烷化剂的一种，其存在多个活性烷基，可以烷化磷酸基、嘌呤、嘧啶等而与DNA发生作用。其中鸟嘌呤N7是最容易起反应的位点。烷化后的鸟嘌呤易于离子化，由原来的酮式变为不稳定的烯醇式，从而与胸腺嘧啶配对而不与胞嘧啶配对，造成GC-AT转换。此外，NTG还可以引起染色体小范围切除、移码突变及GC对的缺失等突变。另外据认为NTG的作用是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内的DNA复制系统，从而诱发了变异。

步骤（以黑曲霉为例）：1、单孢子悬液制备：取斜面，加入6ml，0.1mol/L，pH6.0的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管并过滤，制得单孢子悬液，使孢子良好分散，为诱变做准备。

2、NTG溶液制备：精确称取2mgNTG，加入2ml，0.1mol/L，pH6.0的磷酸缓冲液，,与暗处震荡溶解，防止NTG分解。

3、诱变处理：吸取NTG液1ml，加入到1ml孢子悬液中，30℃震荡30min，稀释1000倍停止作用，然后以10-2和10-4两个稀释度分离培养，30℃，3d后计数。

4、死亡率计算：将未处理的孢子液1ml加入1ml磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离，30℃培养3d，根据前后处理活孢子数计算死亡率。

5：筛选目标菌株。

10微生物紫外线诱变后应如何培养？为什么？

答：UV诱变后应在红光下进行后续操作，并放置在黑暗条件下培养。

原因：微生物经UV诱变后，如果立即暴露在可见光下，出现明显降低死亡率的现象即光复活作用。微生物经紫外照射后，DNA分子中会产生嘧啶二聚体，造成局部DNA分子无法配对，引起微生物死亡或突变。为这种二聚体会在黑暗下被光解酶结合，这种复合物在可见光下被激活，使二聚体重新分解成单体，从而降低了微生物的死亡率或突变率。

2006微生物实验操作复试

5如何测量酿酒酵母的大小？

答：酿酒酵母个体较小，需要在显微镜下借助于特殊的测量工具——测微尺来测定其大小。测微尺包括镜台