枯草芽孢杆菌的分离纯化

• 原理：许多芽孢杆菌产生淀粉酶，能将培养基中的淀 粉水解，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。
• 培养基：在肉汤琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分装 于三角瓶。0.1MPa(15lbf/in2)20min灭菌备用。
• 步骤：
将培养基做成平板，凝固后取菌种点种于平板上
（每皿点种2点），一般于30摄氏度培养2—4天，形 成菌落后，在平板上滴加碘液，以铺满菌落为度，平
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发酵过程中采用单因素试验方法,考察
不同培养温度(26、28、30、32、34、
36℃)、培养时间(26、32、38、44、50、
80h)、接种量 (1%、2%、3%、5%、10%)、
初始pH值(5、6、7、8、9)、培养基(Landy
培养基、Landy修饰培养基Ⅰ、 Landy修饰
培养基Ⅱ、LB培养基、无机盐培养基)对脂
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脂肽类抗生素的HPLC定量检测
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将脂肽类抗生素粗提物过Sephadex
Fra Baidu bibliotek
LH-20层析柱，每管收集液分别经真空干燥
后,加入0·2ml乙醇溶解。对每管乙醇溶液进
行平板抑菌试验,试验真菌为油菜菌核病菌,
将具有抑菌活性的收集液合并在一起,用离
心浓缩仪浓缩至完全干燥,即为脂肽类抗生
素的干重。
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讨论
• 枯草芽孢杆菌脂肽类抗生素在防治植物 病害上具有广阔的应用前景,但由于其产量 不高使其应用受到限制，通过研究枯草芽 孢杆菌的发酵技术和对其进行遗传改造可 以提高脂肽类抗生素产量。
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肽类抗生素产量的影响。
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• 结果表明,最佳培养条件为Landy培养基, 初始pH7·0,接种量3%,发酵培养温度30℃, 发酵时间38h。
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脂肽类抗生素的提取——酸沉淀法
• 培养结束后,7000r/min离心10min,取上 清，加 HCl调节pH为5·0、4·5、4·0、3·5、 3·0、2·5、2·0,7000r/min离心10min,收集 沉淀。将沉淀在60℃ 的烘箱中干燥18h,称 重即为脂肽类抗生素粗提物的干重。比较 不同pH条件下沉淀的干重,以确定完全沉淀 脂肽类抗生素所需的最佳pH值。
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• （4）挑菌及纯化：从上述分离的平板上分 别挑取单菌落中部分菌体，在牛肉膏蛋白 胨培养基上划线纯化。（菌体应呈杆状， 具芽孢，宽度一致；菌落颜色、形状、质 地、透明度等均一致）
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生理生化鉴定
• 一 过氧化氢酶测定 将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，
培养1—2天。取一载玻片，在上面加一滴 3—10%的过氧化氢，挑取一环菌苔，在过 氧化氢溶液中涂抹，若有气泡（氧气）出 现为阳性，无气泡者为阴性。
板呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀 粉被水解，透明圈的大小，可表明水解能力的大小。
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• 经生理生化鉴定，确定是芽孢杆菌属纯 种后，从中选择一株转接于牛肉膏蛋白胨 斜面上，置37℃培养1-2天后备用
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发酵条件的优化
• 将纯化的菌种转接至LB平板上,37℃培 养24h,用接种环取活化菌种,接种于 100mlLB液体培养基,30℃、200r/min培养 24h作为种子菌。
PH 6.5，每管分装4—5ml，0.06MPa（8lbf/in2）30min灭菌
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步骤：
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将芽孢杆菌测试菌接种于上述培养液中，一般于30摄氏度培
养4天，取培养液（约2ml）和等量的40%NAOH相混合，加少量
肌酸（约0.5—1mg），充分振荡，2—5min后如培养液呈红色，
即为试验阳性。
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四 淀粉水解
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分离步骤
• （1）土样的采集：取土壤表层5-10cm下的 肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋带 回实验室分离。
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• （2）平板的制备：溶化三角瓶中的牛肉汤 蛋白胨培养基，以每皿20ml左右倒6个平板。
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• （3）稀释分离法：称取土壤5g放入含有 45ml水的三角瓶中，摇动片刻，然后将此 瓶用小火加热至悬浊液沸腾，维持15min。 而后静止5min，吸取上层液0.1ml加入到含 有4.5ml无菌水的试管中，制成1:100浓度的 悬液，然后吸取土壤悬浊液0.2ml滴加到牛 肉膏蛋白胨培养基平板上，用涂布棒均匀 涂布，并将培养基倒置于37℃恒温培养1-2 天。
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原理：有些芽孢杆菌发酵葡萄糖产酸，并将产生的酸进一步转化
为中性化合物，如乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性环境中可
被氧气成二乙酰，后者与蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生
成红色化合物，即表示试验阳性。若在培养基中加入少量肌酸以
补充胍基，可加速反应。
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培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，蒸馏水 1000ml。调节
枯草芽孢杆菌的分离纯化
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目录
• 菌种简介 • 分离步骤 • 生理生化鉴定 • 发酵条件的优化 • 脂肽类抗生素的提取——酸沉淀法 • 脂肽类抗生素的HPLC定量检测 • 讨论
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菌种简介
• 无荚膜，周生鞭毛，革兰氏阳性菌，有 芽孢，菌落表面粗糙不透明，污白色或微 黄色，需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及 淀粉，分解色氨酸形成吲哚。广泛分布在 土壤及腐败的有机物中。
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• 枯草芽孢杆菌在自然生长和发酵培养 产生的脂肽类抗生素具有很强的抗真菌、 病毒、肿瘤、支原体活性，在防治植物病 害上具有广阔的应用前景。
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分离原理
• 芽孢杆菌能产生芽孢，在沸水中加热不 会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细 菌会失去活性，因而得到芽孢菌属，经过 进一步的分离及生理生化鉴定得到枯草芽 孢杆菌。
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• 二 需氧性试验 • 原理：不同种类的芽孢杆菌对氧气的需求
性常有差异，因此本实验可作为鉴定芽孢 杆菌的一个较重要指标。 • 操作步骤：菌液穿刺接种到上述培养基中， 一般于培养3—7天观察结果。若芽孢杆菌 在琼脂柱表面生长为好氧菌，沿着穿刺线 上生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌
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三、乙酰甲基甲醇实验