2009 分子生物学实验-讲义

《现代生物学实验》分子生物学部分
2009、9
目录
内容页
实验一SDS法提取植物核酸 (2)
实验二CTAB法提取植物核酸 (2)
实验三DNA的纯化及利用紫外分光光度计检测DNA含量及纯度 (3)
实验四质粒DNA的提取 (4)
实验五PCR技术扩增DNA (5)
实验六质粒DNA酶切 (6)
实验七DNA的琼脂糖凝胶电泳检测及目的DNA片段的回收 (7)
实验八D N A片段的重组 (9)
实验九大肠杆菌感受态细胞制备 (10)
实验十外源基因遗传转化 (11)
实验十一转基因水稻GUS报告基因检测 (12)
实验十二分子生物学实验设计 (11)
实验一SDS法提取植物核酸
一、实验目的
通过本实验了解SDS法提取植物组织总核酸的原理及方法。

二、实验原理
利用高浓度的SDS在较高温度下（55-65度）裂解细胞，破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来，通过酚和氯仿抽提去除蛋白质、脂质、多糖等，通过RNase A 消化去除RNA，最后用乙醇沉淀DNA。

该法操作简便，能满足大多数实验需要。

三、材料
市售新鲜豆苗，菠菜等。

四．仪器用品
1．用具
玻棒、烧杯（250毫升），离心管（100毫升）、研钵、量筒（100毫升）、分析天平、紫外分光度计，37O C水浴、离心机等。

2．药品配制
（1）研磨缓冲液（pH7.0）：分别称取一定量的NaCl、柠檬酸三钠和EDTA三种药品，定容于1000毫升蒸馏水中（0.45mol/LNaCl，0.045mol/L柠檬酸三钠，0.1mol/LEDTA）（3×SSC），再在定容好的溶液中按1%比例加入SDS，调pH到7.0。

（2）氯仿-异戊醇：按照氯仿：异戊醇=24：1比例配制。

（3）溶解DNA溶液（pH7.0）：即0.1×SSC 溶液，含有0.015mol/LNaCl，0.0015mol/L柠檬酸三钠。

（4）95%或100%乙醇4︒C冰箱预冷
五、实验步骤
1.称新鲜豆苗或菠菜嫩叶1克，放在研钵内，加入与2-3ml的体积的研磨缓冲液，充分将植物组织研磨成为浆状物。

2.将750ul浆状物加入一个1.5ml离心管内，加入等体积（750ul）的氯仿—异戊醇混合液，盖上管盖，剧烈摇晃30秒钟，以脱除组织蛋白质，转移至1.5 ml离心管中。

3. 离心管平衡后，10000转/分离心5min，形成三层，小心的吸取上层含核酸的水溶液，弃去中间的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。

4.将收集的水溶液放入一个新的1.5ml离心管中，在72︒C下继续保温3分钟（不要超过4分钟）以灭活组织内的DNA酶，然后迅速取出离心管，放在冰水浴中冷却到室温。

5.取0.5ml溶液转入1.5ml离心管，加等体积95%或100%预冷乙醇水溶液，玻棒取出核酸，溶于适量0.1*SSC中，以待纯化使用。

五、作业
1. 在本实验中所用SDS在提取核酸过程中有何作用？
2. 在上清液中加入95%（或100%）乙醇后，你看到出现的核酸是什么状态？
实验二CTAB法提取植物核酸
一、实验目的
通过本实验了解CTAB法提取植物组织核酸的原理及基本操作步骤。

二、实验原理
植物细胞中DNA主要存在于细胞核内，称核DNA或染色体DNA，细胞质中含有少量的DNA，分布在线粒体和叶绿体内。

植物细胞内的各种DNA总称为总DNA。

核DNA分子呈极不对称的线状结构，一条染色体为一个DNA分子。

高等植物的核DNA约为109bp，如此细长的分子对任何机械力的作用都十分敏感。

在DNA提取过程中，DNA分子的降解很难避免，因此提取得到的只是DNA分子的片段。

植物DNA的提取常用有CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）和SDS（十二烷基硫酸钠）两种方法：CTAB是一种去垢剂，能与核酸形成复合物，这些复合物在高盐溶液（0.7 mol/L NaCl）中可溶解，且能稳定存在，但如果降低盐的浓度（0.3 mol/L NaCl），CTAB与核酸的复合物就会因溶解度降低而沉淀出来，而大部分的蛋白质及多糖仍溶于溶液中，这样通过离心就可以去除蛋白质、多糖等杂质。

最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。

三、材料
新鲜干净的菠菜叶片或豆苗
四．试剂和器材
(1) 1M Tris-HCl(pH8.0) 500mL :60.57g Tris,pH8.0
(2) CTAB分离缓冲液
2%CTAB(W/V), 1.4mol/LNaCL,20mmol/LEDTA,100mmol/L Tris-HCL(pH8.0), 0.2%巯基乙醇共100mL：2g CTAB, 8.18g NaCL, 0.74g EDTA.Na2.2H2O，加入10mL 1mol/L的Tris-HCl(pH8.0), 0.2mL巯基乙醇，加水定容到100mL。

(3) 70%的乙醇，异丙醇，氯仿-异戊醇（24:1），液氮
(4)TE缓冲液10mmol/L Tris-HCL（pH7.4）, 1mmol/L EDTA
(5) 研钵（研棒），恒温水浴锅（37-100︒C），离心机，离心管。

五、实验步骤
1.取新鲜菠菜嫩叶或豆苗4克，放在预冷的研钵内，加液氮研磨至粉末状，将粉末转移
至10ml离心管中，加入8ml的60︒C预热的2*CTAB，轻轻震荡后置于60︒C水浴锅中45min，并不时震荡。

2.取出离心管，冷却至室温后，加入等体积的氯仿—异戊醇（24：1）的混合液，充分混匀。

3.将离心管内的溶液进行平衡，4000转/分的条件下离心10min，吸取上清液加入其2/3倍体积的异丙醇，轻轻混匀使核酸析出。

4.用玻棒捞出核酸，用70%的乙醇洗涤，室温干燥后溶于适量1*TE或水中冻存于－20︒C 备用。

五、作业
1.实验中所用的各种药品在提取核酸过程中各自有何作用？
2. 在上清液中加入异丙醇后，请用图解说明上清液中出现的核酸。

实验三DNA的纯化及利用紫外分光光度计检测DNA含量及纯度
一、实验目的
了解DNA纯化的原理及步骤，并了解分光光度计法测DNA浓度和纯度的方法及原理。

二、实验原理
利用RNA酶去除植物组织总核酸中的RNA杂质，用有机溶剂抽提溶液中的蛋白质、多糖及酚类物质，再用95%的预冷酒精沉淀和清洗即可得到较纯的DNA。

根据DNA和蛋白质分别在260nm和280nm波长的最大吸收值，即可通过计算由紫外分光光度计测定DNA溶液在260nm和280nm O.D值的比值，确定DNA溶液的纯度。

O.D(260)/O.D(280)应等于1.8。

若大于1.8，说明溶液中含RNA杂质，可用RNA酶重新处理。

若小于1.6，说明溶液中有蛋白质及酚，可用有机溶剂再次抽提。

采用紫外分光光度计分析法确定DNA浓度可利用如下公式进行计算：
1O.D（260nm）=50（ug/ml）
三．仪器用品
1．仪器
紫外分光度计，离心机，移液枪，
2.试剂
25mg/mL的RNA酶，氯仿—异戊醇（24：1），95%乙醇
四、实验步骤
1.在实验一已提好的植物核酸粗提液中加RNA酶，使最终浓度为50ug /ml，放入37ºC 的水浴锅中半小时。

2.加入等体积的氯仿—异戊醇（24：1）的混合液，充分混匀并于8000转/分的条件离心5min，吸取上清液并加入2倍体积预冷的95%乙醇，轻轻混匀，使DNA析出。

3.在4 ºC 4000转/分的条件下离心5min，去上清液，晾干沉淀，加适量1*TE或无菌水，使DNA溶解。

4.用紫外分光光度检测DNA纯度和浓度。

四、作业：
1.记录你检测DNA溶液在260nm和280nm两个波长下的OD值。

2.根据测得结果分析你提取DNA溶液的纯度和浓度。

实验四质粒DNA的提取
一、实验目的
通过本实验了解碱裂解法进行质粒DNA的少量制备的方法与原理。

二、实验原理
在强碱环境中，大分子量核DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。

将pH调至中性并在高盐环境中，核DNA之间交联形成不溶性网状结构，但质粒DNA 仍然呈可溶状态。

三、主要溶液
溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA(pH8.0)，25mmol/L Tris-Cl(pH8.0)缓冲液
溶液Ⅱ：1%（m/V）SDS，0.2N NaOH 溶液
溶液Ⅲ：KAC、HAC高盐溶液(所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L)
四、实验步骤
1.吸取1.5ml大肠杆菌菌液，5000转/分离心5分钟，去上清液，若菌体量不足，可重复一次。

2.加100ul预冷的溶液Ⅰ，振荡重悬沉淀的菌体。

3.加200ul新配制的溶液Ⅱ（0.4N NaOH与2%的SDS等体积混合），盖紧管口，快速翻倒离心管5-6次，静置3-5分钟，不可超过5分钟。

4.加150ul溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒混匀5-6次，静置5分钟，12000转/分，离心10分钟。

5.取上清液（约450ul）于另一离心管中，加等体积氯仿（450ul），剧烈振荡混匀，12000转/分离心10分钟。

6.取上情液约400ul于另一离心管，加2倍体积（800ul）的无水乙醇，于－20℃沉淀30分钟。

7. 12000转/分离心10分钟，弃上清，70％乙醇洗一次。

8. 干燥，加20-30ul 含RNase的无菌水，于37℃溶解（消化）30分钟，若暂时不用，于－20℃保存。

五、作业
简述本试验使用的各种试剂在质粒DNA提取中的作用。

实验五质粒DNA酶切处理
一、实验目的
通过本实验掌握采用限制性内切酶酶切DNA作用的原理和操作方法，并了解限制性内切酶酶切DNA的各种影响因素。

二、实验原理
大多数限制性内切酶识别4~6个具有回文对称性质的碱基，本实验所用的内切酶EcoRI能识别6个碱基的靶序列，它们的剪切方式分别是：
GAATTC
CTTAAG
三、实验步骤
取1个无菌离心管按如下顺序及要求操作：
1.加16ul无菌水。

2.加3ul EcoRI 10*缓冲液。

3.加入10ul 上次试验（试验五）提取的质粒。

4.加1ul 内切酶EcoRI（15个作用单位）。

5.混匀，37ºC保温1个小时。

6.电泳分析或-20ºC保存备用。

四、作业
分析可能影响内切酶作用的各种因素。

实验六PCR技术扩增DNA
一、实验目的
通过本实验掌握利用PCR技术扩增目的DNA的原理和操作方法。

二、实验原理
通过酶促反应在体外成百万倍地扩增一段目的基因，它是基于位于待扩增目的基因两端的两个引物（primer）与该目的基因序列退火而后延伸最终达到扩增目的的。

大致过程：
变性退火延伸（94~98ºC）（37~65ºC）（72ºC）
变性、退火、延伸n次循环
三、实验步骤
1.在一个灭菌的新的离心管中按如下顺序及要求操作：
无菌水19ul
10*缓冲液5ul
MgCl2 4ul
dNTP 1ul 混匀
引物3 5ul（50pmol）
引物4 5ul（50pmol）
母板DNA 2ul（100ng）
Taq酶5ul（一个作用单位）
2. 在PCR仪上进行循环扩增
反应程序：94ºC预变性5min
94ºC变性40sec
55ºC退火40sec 30个循环
72ºC延伸45sec
72ºC延伸10min
四、作业
1.分析影响PCR结果的各种可能的因素。

2.在反应程序中，你认为最有可能导致非特异性扩增的过程是哪一步？
实验七DNA的琼脂糖凝胶电泳检测及回收
一、实验目的
1.学习电泳法测定DNA浓度与纯度的方法；
2.了解电泳过程中各种因素对结果的影响；
3.掌握制胶、电泳等基本操作技术。

二、实验原理
DNA的等电点偏酸，当处于电泳条件（PH=8）时，DNA链上带有负电荷，在电场力的作用下会向正极泳动，由于DNA链上负电荷的增加伴随着DNA分子质量的增加而增加。

所以，实际上DNA分子的荷质比始终是一常数，电泳中分离DNA靠的是分子的大小与构型的不同。

三、实验步骤
1.配制琼脂糖凝胶
琼脂糖+TAE或TBE缓冲液+EB(溴乙锭)
2.点样样品
总DNA 、总RNA 、质粒酶切DNA 、重组DNA 、PCR产物、标准DNA
3.制样：浓度为0.5ug/ul DNA样品5ul+2ul溴酚蓝于封口膜上混合
4.加样
5.70V稳压电泳约2小时
6.紫外分析仪观察并分析电泳结果
四、作业
1.分析可能影响琼脂糖凝胶电泳的各种因素。

2.对你所加的各种样品在凝胶上显示的条带状态进行详细说明。

实验八DNA片段的重组
一、实验目的
通过本实验掌握DNA连接酶连接DNA的原理和操作方法，并了解影响连接酶作用的各种因素。

二、实验原理
T4连接酶能催化双链DNA的3’-OH与5’-P末端之间生成磷酸二酯键，并能在不需要其他催化剂的条件下进行末端连接反应。

三、实验材料
已单酶切的pBR322质粒DNA （或已单酶切的实验六质粒DNA）、T4连接酶
三、实验步骤
取两个无菌离心管按如下顺序及要求操作：
1.加4ul的已酶切的质粒DNA，或加上次酶切的pBR322DNA4ul。

2.加2ul的10*缓冲液（T4连接酶缓冲液）
3.加无菌去离子水12ul或根据体积总数推算得6ul。

4.加T4 DNA连接酶2ul。

5.这样总反应体积20ul，振荡，离心3~5秒。

6.22ºC保温4小时，65度水浴10分钟。

五、作业
1.认真完成实验操作，为以后实验准备材料。

2.分析可能影响连接酶作用的各种因素。

实验九大肠杆菌感受态细胞制备
一、实验目的
1.掌握采用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞方法；
2.了解制备大肠杆菌感受态细胞操作过程中各种可能的影响因素。

二、实验原理
将正在生长的大肠杆菌在低温（0ºC）下加到低渗CaCl2溶液中，会造成大肠杆菌细胞膨胀（形成原生质球），由此可人工诱导大肠杆菌呈现易于接受外源DNA的感受态状态。

三、实验步骤（所有操作必须在超净工作台上进行）
1.取10ml菌液
2.冰上冷却10min
3.4000rpm/min离心10min(4ºC)
4.弃上清液
5.用4ml冰冷0.1mol/L CaCl2悬浮细胞
6.冰上放置25min
7.4000rpm/min离心10min(4ºC)
8.弃上清液
9.用1ml冰冷0.1mol/L CaCl2悬浮菌体
10.制备甘油保菌管于-70 ºC保存备用(甘油终浓度为15%)
四、作业
叙述CaCl2在制备大肠杆菌感受态细胞中的作用。

实验十外源基因遗传转化
一、实验目的
通过实验掌握将重组DNA转化感受态大肠杆菌的操作方法。

二、实验原理
大肠杆菌在低温时由低渗CaCl2的作用下细胞膨胀形成原生质球，同加入在转化混合物中的重组质粒DNA形成一种粘着在细胞表面上的对Dnase抗性的复合物。

当温度升为42ºC（热激处理）时，这种复合物便会被细胞所吸收。

在富裕培养基中生长一段时间使转化基因实现表达后，再涂布在选择性的培养基中即可分离转化子。

三、实验步骤（所有操作必须在超净工作台上进行）
1.取50ul感受态细胞加入一无菌离心管。

2.加5ul 重组载体。

3.冰上放置30’。

4.42ºC热激处理2’
5.0 ºC 2’
6.加100ul 37ºC预热完全培养基（2*YT ）
7.37ºC振摇1小时
8.涂布平板，培养过夜。

第二天观察转化结果。

四、作业
记录转化子数目，并分析可能影响转化率的原因。

实验十一转基因水稻GUS报告基因检测
一、实验目的
通过本实验掌握在转基因植物中检测GUS报告基因表达活性的操作方法，并掌握通过GUS阳性和阴性分离比推测外源基因整合的拷贝数。

二、实验原理
GUS基因存在某些细菌体内，编码β-葡萄糖醛酸糖苷酶，该酶的作用底物是无色的X-葡萄糖苷酸（简称X-gluc）。

当把表达β-葡萄糖醛酸糖苷酶的转基因植物组织与X-gluc一起温育时，GUS酶就会将反应体系中无色的X-gluc底物水解产生出深蓝色的5-溴-4氯靛蓝。

该反应很容易用普通的生化反应检测出来，GUS基因称为报告基因，在未转基因植物中，这些酶及其所催化的反应几乎完全不存在。

三、实验步骤
1.取转基因稻米和对照稻米各24粒，剥去颖壳。

2.各切1/4胚乳放置于96孔板中，加适量X-gluc溶液8ul。

3.37ºC保温2小时。

4. GUS+、GUS-计数，并计算比值。

四、作业
叙述转基因植物检测的主要方法。