酶工程第三章发酵生产
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酶工程 第三章酶的发酵生产 第一节酶生物合成的基本理论
转录是以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶 （转录酶）的作用下，生成RNA的过程。
第一节 酶生物合成的基本理论
转录时，RNA聚合酶首先结合到DNA的特定位点（启动基因）上，DNA的 双螺旋链部分解开，以其中一条链为模板，通过碱基互补方式结合进第一个 核苷三磷酸，然后随着RNA聚合酶的移动，DNA双螺旋逐渐解开，按照模板上 的碱基顺序逐个加入与其互补的核苷三磷酸并聚合而生成多聚核苷酸链。在 RNA聚合酶后面生成的多聚核苷酸链立即与模板分开，DNA分子的两条链又重 新缠绕形成双螺旋。（图3-1）
第一节 酶生物合成的基本理论
三、酶生物合成的调节
如上所述，酶的生物合成要经过一系列的步骤，需要 诸多因素的参与。故此，在转录和翻译过程中，许多因素 都会影响酶的生物合成。那么，究竟哪些因素对酶的生物 合成起主要的调节控制作用呢？研究结果表明，至少在原 核生物中，甚至在所有生物中，转录水平的调节控制对酶 的生物合成是至为重要的。
的过程,称为酶生物合成的诱导作用。简称为诱导作用。 起诱导作用的物质，称为诱导剂。例如，乳糖诱导β—半 乳糖苷酶的合成等。
酶生物合成的诱导作用过程如图3-4所示。
第一节 酶生物合成的基本理论
第一节 酶生物合成的基本理论
(B)
图3-4酶生物合成的诱导作用 （A）-----无诱导物时 （B）----添加诱导物时
转录水平调节控制，又称为基因的调节控制。这种控 制理论最早是由雅各（Jacob）和莫诺德(Monod)于1960年 提出的操纵子学说来阐明的，1966年发现了启动基因，使 这一调节控制理论不断完善。
第一节 酶生物合成的基本理论
根据基因调节控制理论，在DNA分子中，与酶生物合 成有密切关系的基因有4种。它们是调节基因(Regulator gene)、启动基因(Promoter gene)、操纵基因(Operator gene)和结构基因(Strutural gene)。其中，结构基因与 酶有各自的对应关系，结构基因中的遗传信息可转录成 mRNA上的遗传密码，再经翻译成为酶蛋白的多肽链。操纵 基因可以特异性地与调节基因产生的边构蛋白（阻抑蛋白） 中的一种结构结合，从而操纵酶合成的时机及速度。结构 基因与操纵基因一起称为操纵子。启动基因决定酶的合成 能否开始，启动基因由两个位点组成，一个是RNA聚合酶 的结合位点，另一个是环腺苷酸（cAMP）与环腺苷酸接受 蛋白（CRP）的复合物（cAMP- CRP）的结合位点。只有在 cAMP- CRP复合物结合到启动基因的位点上时，RNA
第一节 酶生物合成的基本理论
转录时，RNA聚合酶首先结合到DNA的特定位点（启动基因）上，DNA的 双螺旋链部分解开，以其中一条链为模板，通过碱基互补方式结合进第一个 核苷三磷酸，然后随着RNA聚合酶的移动，DNA双螺旋逐渐解开，按照模板上 的碱基顺序逐个加入与其互补的核苷三磷酸并聚合而生成多聚核苷酸链。在 RNA聚合酶后面生成的多聚核苷酸链立即与模板分开，DNA分子的两条链又重 新缠绕形成双螺旋。（图3-1）
第一节 酶生物合成的基本理论
三、酶生物合成的调节
如上所述，酶的生物合成要经过一系列的步骤，需要 诸多因素的参与。故此，在转录和翻译过程中，许多因素 都会影响酶的生物合成。那么，究竟哪些因素对酶的生物 合成起主要的调节控制作用呢？研究结果表明，至少在原 核生物中，甚至在所有生物中，转录水平的调节控制对酶 的生物合成是至为重要的。
的过程,称为酶生物合成的诱导作用。简称为诱导作用。 起诱导作用的物质，称为诱导剂。例如，乳糖诱导β—半 乳糖苷酶的合成等。
酶生物合成的诱导作用过程如图3-4所示。
第一节 酶生物合成的基本理论
第一节 酶生物合成的基本理论
(B)
图3-4酶生物合成的诱导作用 （A）-----无诱导物时 （B）----添加诱导物时
转录水平调节控制，又称为基因的调节控制。这种控 制理论最早是由雅各（Jacob）和莫诺德(Monod)于1960年 提出的操纵子学说来阐明的，1966年发现了启动基因，使 这一调节控制理论不断完善。
第一节 酶生物合成的基本理论
根据基因调节控制理论，在DNA分子中，与酶生物合 成有密切关系的基因有4种。它们是调节基因(Regulator gene)、启动基因(Promoter gene)、操纵基因(Operator gene)和结构基因(Strutural gene)。其中，结构基因与 酶有各自的对应关系，结构基因中的遗传信息可转录成 mRNA上的遗传密码，再经翻译成为酶蛋白的多肽链。操纵 基因可以特异性地与调节基因产生的边构蛋白（阻抑蛋白） 中的一种结构结合，从而操纵酶合成的时机及速度。结构 基因与操纵基因一起称为操纵子。启动基因决定酶的合成 能否开始，启动基因由两个位点组成，一个是RNA聚合酶 的结合位点，另一个是环腺苷酸（cAMP）与环腺苷酸接受 蛋白（CRP）的复合物（cAMP- CRP）的结合位点。只有在 cAMP- CRP复合物结合到启动基因的位点上时，RNA
第三章酶工程在食品工业中的应用
（一）酶提取的主要方法
1.盐溶液提取 2.酸溶液提取 3.碱溶液提取 4.有机溶剂提取
1.盐溶液提取
2.酸溶液提取
3.碱溶液提取
4.有机溶剂提取
（二）酶提取过程的注意事项
1. 温度 为了防止酶的变性失活, 提取时温度不宜高。特别是采用有机溶剂提取时, 温度应
控制在-10℃。有些酶对温度的耐受性较高, 如酵母醇脱氢酶、细菌碱性磷酸 酶、胃蛋白酶, 可在37℃或更高一些温度下提取。 2. pH 提取时溶液的pH值应该远离酶的等电点, 可增加酶的溶解度。除了酸溶液提取或 碱溶液提取, 提取时溶液的pH 不宜过高或过低, 以防止酶的变性失活。 3. 提取液的体积 提取液的用量增加, 可提高提取率, 但是过量的提取液, 使酶浓度降低, 对进一步 的分离纯化不利, 故提取液的用量一般为含酶原料体积的3-5倍, 可一次提取。 4. 添加保护剂 在酶提取过程中, 为了提高酶的稳定性, 防止酶变性失活, 可以加入适量的酶作用 底物, 或其辅酶, 或加入某些抗氧化剂等保护剂。
第三章酶工程在食品工 业中的应用
2024年7月15日星期一
第一节 酶工程的概况
一、酶工程发展历史 二、酶的基本概念、分类与命名 三、酶的活力测定 四、微生物发酵产酶 五、酶的提取与分离纯化 六、酶与细胞固定化 七、酶分子修饰 八、酶反应器及反应操作控制
一、酶工程发展历史
二、酶的基本概念、分类Байду номын сангаас命名
六、酶与细胞固定化
七、酶的分子修饰
八、酶反应器
1.常见的酶反应器类型和特点 2.酶反应器的选择和使用 3.酶反应器使用中应注意的问题
1.常见的酶反应器类型和特点
2.酶反应器的选择和使用
3.酶反应器使用中应注意的问题
酶工程课程复习资料整理
绪论一．酶是生物催化剂酶是具有生物催化功能的生物大分子，按其化学组成的不同可以分为两类：蛋白类酶（P-酶）与核酸类酶（R-酶）。
理解：1、酶是由生物细胞产生2、酶发挥催化功能不仅在细胞内，在细胞外亦可二．酶学研究简史1897年，Buchner兄弟发现，用石英砂磨碎的酵母细胞或无细胞滤液能和酵母细胞一样进行酒精发酵。
标志着酶学研究的开始。
说明：酶分子不仅只是在细胞内起作用，而且在细胞外同样具有催化功能。
这一发现开启了现代酶学，乃至现代生物化学的大门。
三．酶工程的现状：目前大规模利用和生产的商品酶还很少。
第一章．酶学概论第一节．酶作为生物催化剂的显著特点一．酶作为生物催化剂的显著特点：高效、专一二．同工酶（概）：能催化相同的化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成不同的一组酶。
三．共价修饰调节1．概念：通过其它的酶对其结构进行共价修饰，从而使其在活性形式和非活性形式之间相互转变。
2．常见修饰类型：磷酸化与去磷酸化；腺苷酸化与脱腺苷酸化；尿苷酸化与脱尿苷酸化；泛素化；类泛素化3．例子：糖原磷酸化酶——磷酸化形式有活性（葡萄糖）n+Pi→（葡萄糖）n-1+1-磷酸葡萄糖4．常见磷酸化部位：丝氨酸/苏氨酸，酪氨酸和组氨酸四．酶活性调节方式要能判断所举酶的例子是什么类型调节1. 别构调节2. 激素调节：如乳糖合酶修饰亚基的水平是由激素控制的。
妊娠时，修饰亚基在乳腺生成。
分娩时，由于激素水平急剧的变化，修饰亚基大量合成，它和催化亚基结合，大量合成乳糖。
3. 共价修饰调节：如糖原磷酸化酶、磷酸化酶b激酶4．限制性蛋白水解作用与酶活性控制。
如酶原激活5．抑制剂和激活剂的调节6．反馈调节7．金属离子和其它小分子化合物的调节8．蛋白质剪接五．反馈调节（概）：催化某物质生成的第一步反应的酶的活性，往往被其终端产物所抑制。
这种对自我合成的抑制叫反馈抑制。
A-J ：代谢物实线箭头：酶促催化步骤虚线箭头：反馈抑制步骤代谢途径的第一步和共同底物进入分支途径的分支点是反馈抑制的最为重要的位点。
酶工程期末复习题
第一章绪论问题：试述木瓜蛋白酶的生产方法？答：木瓜蛋白酶可以采用提取分离法、基因工程菌发酵法、植物细胞培养法等多种方法进行生产。
(1)提取分离法：从木瓜的果皮中获得木瓜乳汁，通过各种分离纯化技术获得木瓜蛋白酶。
(2)发酵法：通过DNA重组技术将木瓜蛋白酶的基因克隆到大肠杆菌等微生物中，获得基因工程菌，在通过基因工程菌发酵获得木瓜蛋白酶。
(3)植物细胞培养法：通过愈伤组织诱导获得木瓜细胞，在通过植物细胞培养获得木瓜蛋白酶。
第二章微生物发酵产酶1、解释酶的发酵生产、酶的诱导、酶的反馈阻遏(产物阻遏)、分解代谢物阻遏。
诱导物的种类？答：酶的发酵生产：利用微生物的生命活动获得所需的酶的技术过程；酶的诱导：加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为诱导作用；产物阻遏（反馈阻遏）：指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。
分解代谢物阻遏（营养源阻遏）：是指某些物质经过分解代谢产生的物质阻遏其他酶合成的现象。
诱导物的种类：诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物，有的也是反应产物。
2、微生物产酶模式几种？特点？最理想的合成模式是什么？答：（1）同步合成型特点：a.发酵开始，细胞生长，酶也开始合成，说明不受分解代谢物和终产物阻遏。
b.生长至平衡期后，酶浓度不再增长，说明mRNA很不稳定。
（2）延续合成型特点：a.该类酶一般不受分解代谢产物阻遏和终产物阻遏。
b.该酶对应的mRNA是相当稳定的。
（3）中期合成型特点：a.该类酶的合成受分解代谢物阻遏和终产物阻遏。
b.该酶对应的mRNA不稳定。
（4）滞后合成型特点：a.该类酶受分解代谢物阻遏和终产物阻遏作用的影响，阻遏解除后，酶才大量合成。
b.该酶对应的mRNA稳定性高。
选择：在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期，最理想的合成模式是延续合成型。
3、可以添加什么解除分解代谢物阻遏？表面活性剂的作用？答：（1）一些酶的发酵生产时要控制容易降解物质的量或添加一定量的cAMP，均可减少或解除分解代谢物阻遏作用。
酶工程 第三章酶的发酵生产 第三节发酵工艺条件及控制
为了获得足够多的能量，以满足细胞生长和发酵产酶 的需要，培养基中的能源（一般是碳源提供）必须经有氧 解才能产生大量的ATP。为此，必须供给充足的氧气。
第三节 发酵工艺条件及控制
无机元素是通过添加无机盐来提供的，一般采用水溶 性的硫酸盐、磷酸盐或盐酸盐等。有时也使用硝酸盐，在 提供无机氮的同时，提供无机元素。
4．生长因素 生长因素是指细胞生长繁殖所必不可缺的微量有机化 合物主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素，以及动 植物生长激素等。各种氨基酸是蛋白质和酶的组分；嘌呤 和嘧啶是核酸和某些辅酶的组分；维生素主要起辅酶作用； 动植物生长激素则分别对动物细胞和植物细胞的生长、分 裂起调节作用。有的细胞能够自己合成各种生长因素，而 有的细胞则缺少合成一种或多种生长因素的能力，需由外 界供给，才能正常生长繁殖，这样的细胞称为营养缺陷型。
第三节 发酵工艺条件及控制
在酶的发酵生产中，通常在培养基中加进玉米浆、酵 母膏等，以提供各种必需的生长因素。有时，也加进纯化 的生长因素，以供细胞生长繁殖之需。
现举例几种酶发酵培养基： （1）枯草杆菌BF7658α—淀粉酶发酵培养基：玉米粉 8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠0.8%，硫酸铵0.4%，氧化钙 0.2%，氯化铵0.15%。 （2）枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基：玉米 粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%，米糠1%，磷酸氢二钠0.4%， 磷酸二氢钾0.03%。 （3）黑曲霉糖化发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%， 麸皮1%（PH4.4—5.0）。
第三节 发酵工艺条件及控制
不同细胞生长繁殖的最适PH有所不同。一般细胞和放 线菌的生长最适PH为中性或微碱性（PH6.5—8.0）；霉菌 和酵母的生长最适PH为偏酸性（PH4.0—6.0）；植物细胞 生长的最适PH为5—6。
第三节 发酵工艺条件及控制
无机元素是通过添加无机盐来提供的，一般采用水溶 性的硫酸盐、磷酸盐或盐酸盐等。有时也使用硝酸盐，在 提供无机氮的同时，提供无机元素。
4．生长因素 生长因素是指细胞生长繁殖所必不可缺的微量有机化 合物主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素，以及动 植物生长激素等。各种氨基酸是蛋白质和酶的组分；嘌呤 和嘧啶是核酸和某些辅酶的组分；维生素主要起辅酶作用； 动植物生长激素则分别对动物细胞和植物细胞的生长、分 裂起调节作用。有的细胞能够自己合成各种生长因素，而 有的细胞则缺少合成一种或多种生长因素的能力，需由外 界供给，才能正常生长繁殖，这样的细胞称为营养缺陷型。
第三节 发酵工艺条件及控制
在酶的发酵生产中，通常在培养基中加进玉米浆、酵 母膏等，以提供各种必需的生长因素。有时，也加进纯化 的生长因素，以供细胞生长繁殖之需。
现举例几种酶发酵培养基： （1）枯草杆菌BF7658α—淀粉酶发酵培养基：玉米粉 8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠0.8%，硫酸铵0.4%，氧化钙 0.2%，氯化铵0.15%。 （2）枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基：玉米 粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%，米糠1%，磷酸氢二钠0.4%， 磷酸二氢钾0.03%。 （3）黑曲霉糖化发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%， 麸皮1%（PH4.4—5.0）。
第三节 发酵工艺条件及控制
不同细胞生长繁殖的最适PH有所不同。一般细胞和放 线菌的生长最适PH为中性或微碱性（PH6.5—8.0）；霉菌 和酵母的生长最适PH为偏酸性（PH4.0—6.0）；植物细胞 生长的最适PH为5—6。
酶工程第3版
一、动植物细胞的特点: 动植物细胞的特点
• 1、体积比微生物大； 、体积比微生物大； • 2、对剪切力敏感； 、对剪切力敏感； • 3、生长和代谢速率低，生长倍增时间和发酵 、生长和代谢速率低， 周期长； 周期长； • 4、动物细胞营养要求复杂； 、动物细胞营养要求复杂； • 5、发酵产物不同 、
三、动物细胞发酵
1、动物细胞可以生产多种具有较高价值的药物，特 、动物细胞可以生产多种具有较高价值的药物， 别是疫苗、激素、单克隆抗体和酶等。 别是疫苗、激素、单克隆抗体和酶等。 由动物细胞培养生产的酶有胶原酶， 由动物细胞培养生产的酶有胶原酶，血纤蛋白溶 酶原活性剂等。 酶原活性剂等。 2、动物细胞培养方法： 、动物细胞培养方法： 悬浮培养； 悬浮培养；固定化细胞培养 3、动物细胞发酵工艺植物细胞发酵技术和特点： 、植物细胞发酵技术和特点： 植物细胞发酵技术 发酵特点（与直接提取分离相比较而言）： 发酵特点（与直接提取分离相比较而言）： （1）提高产率； ）提高产率； （2）缩短周期 ）缩短周期; （3）易于管理、减轻劳动强度； ）易于管理、减轻劳动强度； （4）提高质量。 ）提高质量。
2、植物细胞发酵技术 、 (I)高产细胞系的选择： 主要有以下几个途径： 高产细胞系的选择： 高产细胞系的选择 主要有以下几个途径： 材料选择，克隆选择，抗性选择，诱变选择,细 材料选择，克隆选择，抗性选择，诱变选择 细 胞工程和基因工程选择； 胞工程和基因工程选择； (II)影响产物产量的因素： 材料来源 培养基成分， 影响产物产量的因素： 材料来源,培养基成分 培养基成分， 影响产物产量的因素 光照和温度， ，细胞形态分化程度等; 光照和温度，pH，细胞形态分化程度等 (III)提高产物产量的途径： 选择高产细胞系，控 提高产物产量的途径： 提高产物产量的途径 选择高产细胞系， 制细胞生长和分化程度，加入诱导物或前体， 制细胞生长和分化程度，加入诱导物或前体， 两相培养和产物释放，毛壮根培养技术。 两相培养和产物释放，毛壮根培养技术。 (IV)植物细胞培养系统专用的生物反应器。 植物细胞培养系统专用的生物反应器。 植物细胞培养系统专用的生物反应器
酶的发酵生产
酶工程•第一章绪论•第二章酶的发酵生产•第三章酶的分离纯化•第四章酶分子修饰•第五章酶与细胞固定化•第六章酶反应动力学•第七章酶的应用第一章绪论•第一节酶的概述•第二节酶工程概述•第三节酶的生产方法•第四节酶的应用前景第一节酶的概述一. 酶(enzyme)的概念二. 酶的研究历史三. 酶的分类与命名四. 酶的活力测定一. 酶(enzyme)的概念1.酶是催化剂（catalyst）所谓催化剂是一类能改变反应速度，但不改变反应性质、反应方向和反应平衡点，而且本身在反应前后也不发生变化的外在因素。
酶在化学反应中就是充当这样的角色。
2.酶是一种特殊的催化剂3.酶是生物催化剂酶在催化反应时，具有与一般非酶催化剂不同的特点。
其具有催化的高效性、高度专一性及化学本质是蛋白质的特点。
（1）酶具有催化的高效性酶能在温和条件下（常温、常压和近中性PH），极大地提高反应速度，与非酶催化剂相比，酶的催化效率可高出107~1012倍。
如：2H2O2 2H2O + O2该反应的催化剂可以有Fe+、血红素和过氧化氢酶，其催化反应的速度分别是：5.6×10-4mol/mol Fe+.S、6.0×10-1mol/mol血红素.S、3.5×106mol/mol过氧化氢酶.S（2）酶具有催化的高度专一性(specificity)酶作用的的专一性是指酶在催化反应时，通常只作用一种或一类反应物发生相应的反应的特性。
酶作用的专一性主要表现在以下几个方面：a. 绝对专一性：酶只能催化一种反应物发生反应的特性如：谷氨酸脱氢酶只能催化L-谷氨酸脱氢，对其他氨基酸没有作用，其具有绝对专一性。
b. 相对专一性：酶在催化反应时，允许底物分子有一些变化，即可以催化一类反应物发生反应。
如：酯酶催化酸与醇缩合成酯，但对反应物分子的侧链基团专一性不强。
淀粉酶、蛋白水解酶也具有这种专一性。
c. 异构专一性：酶对反应物分子的立体异构体和顺反异构体具有高度的选择能力。
南京林业大学酶工程-3 动、植物细胞发酵产酶讲解
一般为无机氮源。 一般以蔗糖为碳源。
植物细胞培养的工艺条件及其控制（续）
（三）温度的控制 室温（25℃）、 （四）pH值的控制 微酸性（pH5～6） （五）溶解氧的调节控制 代谢慢，耗氧少，对剪切力敏感，搅拌不宜强烈。 （六）光照的控制 （七）前体的添加 提高次级代谢物的产量。 （八）刺激剂(electior)的应用 强化次级代谢产物的生物合成。常用微生物细胞 壁碎片和胞外酶。
动、植物细胞培养与微生物培养区别
动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固 体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨 基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血 清。动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪 切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测 和控制。 植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细 胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养 产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的 培养对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求。
紫草宁及其结构
植物细胞培养的特点（续）
ห้องสมุดไป่ตู้
（2）缩短周期 发酵周期10～30天，种植周期几个月～几年。 （3）易于管理 减低劳动强度；不受地理环境和气候条件等影响。 （4）提高产品质量 主要产物浓度高，易于分离纯化，减少环境中各种有 害物质污染和侵蚀。 （5）其它 生物反应器的设计工艺条件注意的问题。
主要产物
醇类，有机酸， 色素，香精， 激素，疫苗， 氨基酸，抗生素， 药物，酶 单克隆抗体， 酶，核苷酸 酶
二、植物细胞培养的特点
（1）提高产率
例如,紫草宁(shikonin) 生产，发酵细胞中的紫 草宁比 紫菜根 (Lithospermum erythrorhizon)中高10 倍，比产率达到种植紫 草的830倍。
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生
要有黑曲霉、米曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉等。 黑曲霉：黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，
丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Life Sciences
米曲霉：半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，从梗孢科， 曲霉属真菌中的一个常见种。米曲霉菌落生长快， 10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变 为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状， 一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。分生孢 子梗2mm左右。
链霉菌
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3．酵母菌 酵母菌(yeast)是—类单细胞微生物，但不同于细菌，
属于真核微生物。
酿酒酵母 球拟酵母 假丝酵母
拟酵母
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4. 霉菌 霉菌是一类丝状真菌，用于酶的发酵生产的霉菌主
二、产酶微生物的来源
1．土壤中的产酶微生物 2．水体中的产酶微生物 3．空气中的产酶微生物 4．极端环境中的产酶微生物
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Life Sciences
三、产酶微生物的分离和筛选
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第三章 酶的生物合成
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生
第一节 微生物发酵产酶
微生物发酵产酶的优点： 1）微生物种类繁多； 2) 微生物生长周期短，繁育快； 3) 微生物易改造，可通过多种手段育种。
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Sciences
一、产酶微生物的种类 用于酶的生产的细胞必须具备几个条件 (1)酶的产量高 (2) 容易培养和管理 (3) 产酶稳定性好，不易变异退化，不易被感染 (4) 利于酶的分离纯化 (5) 安全可靠，无毒性
丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。
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米曲霉：半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，从梗孢科， 曲霉属真菌中的一个常见种。米曲霉菌落生长快， 10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变 为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状， 一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。分生孢 子梗2mm左右。
链霉菌
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3．酵母菌 酵母菌(yeast)是—类单细胞微生物，但不同于细菌，
属于真核微生物。
酿酒酵母 球拟酵母 假丝酵母
拟酵母
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4. 霉菌 霉菌是一类丝状真菌，用于酶的发酵生产的霉菌主
二、产酶微生物的来源
1．土壤中的产酶微生物 2．水体中的产酶微生物 3．空气中的产酶微生物 4．极端环境中的产酶微生物
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三、产酶微生物的分离和筛选
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第三章 酶的生物合成
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生
第一节 微生物发酵产酶
微生物发酵产酶的优点： 1）微生物种类繁多； 2) 微生物生长周期短，繁育快； 3) 微生物易改造，可通过多种手段育种。
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一、产酶微生物的种类 用于酶的生产的细胞必须具备几个条件 (1)酶的产量高 (2) 容易培养和管理 (3) 产酶稳定性好，不易变异退化，不易被感染 (4) 利于酶的分离纯化 (5) 安全可靠，无毒性
酶工程
同步合成型：提高其对应的mRNA的稳定性，适当降低发酵 温度是可取的措施；
滞后合成型：设法降低培养基中阻遏物的浓度 ，尽量减少甚 至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶 的生物合成提早开始；
中期合成型：在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面下 功夫，使其生物合成的开始时间提前， 并尽量 延迟其生物合成停止的时间。
生长因子：细胞生长繁殖所必需的微量有机化合物。
二、微生物培养基
碳源：淀粉或其水解产物 氮源：混合氮源
三、植物细胞培养基
特点：需要大量的无机盐；需要多种维生素和植物生长激素； 一般要求无机氮源；一般以蔗糖为碳源。
常用的培养基：MS培养基、B5培养基、White培养基、KM-8P培养基等。
配制方法：先配制母液； 大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、微生素 母液、植物激素母液。
第三节 产酶工艺条件及其调节控制
保藏细胞
原生质体
细胞活化 细胞扩大培养
固定化细胞
固定化原生质体
培养基
产酶
分离纯化
预培养
无菌空气
酶
图3-1 酶生产的工艺流程
一、细胞活化与扩大培养
将保藏的细胞接种于新鲜的培养基上，在一定的条件下进行 培养，使细胞的生命活性得以恢复的过程。
条件：适合细胞生长、繁殖的最适条件
四、固定化微生物细胞发酵产酶
固定化细胞：采用各种方法固定在载体上，在一定的空间范 围内进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。
（一）固定化细胞发酵产酶的特点
提高产酶率 可以反复使用或连续使用较长时间 稳定性好 缩短发酵周期，提高设备利用率 产品容易分离纯化 适用于胞外酶等胞外产物的生产
（二）固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制
同，进行光照的调节控制； 前体的添加：目的代谢物代谢途径上游的物质。 刺激剂的应用：常用的刺激剂有微生物细胞的碎片和果胶酶、
滞后合成型：设法降低培养基中阻遏物的浓度 ，尽量减少甚 至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶 的生物合成提早开始；
中期合成型：在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面下 功夫，使其生物合成的开始时间提前， 并尽量 延迟其生物合成停止的时间。
生长因子：细胞生长繁殖所必需的微量有机化合物。
二、微生物培养基
碳源：淀粉或其水解产物 氮源：混合氮源
三、植物细胞培养基
特点：需要大量的无机盐；需要多种维生素和植物生长激素； 一般要求无机氮源；一般以蔗糖为碳源。
常用的培养基：MS培养基、B5培养基、White培养基、KM-8P培养基等。
配制方法：先配制母液； 大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、微生素 母液、植物激素母液。
第三节 产酶工艺条件及其调节控制
保藏细胞
原生质体
细胞活化 细胞扩大培养
固定化细胞
固定化原生质体
培养基
产酶
分离纯化
预培养
无菌空气
酶
图3-1 酶生产的工艺流程
一、细胞活化与扩大培养
将保藏的细胞接种于新鲜的培养基上，在一定的条件下进行 培养，使细胞的生命活性得以恢复的过程。
条件：适合细胞生长、繁殖的最适条件
四、固定化微生物细胞发酵产酶
固定化细胞：采用各种方法固定在载体上，在一定的空间范 围内进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。
（一）固定化细胞发酵产酶的特点
提高产酶率 可以反复使用或连续使用较长时间 稳定性好 缩短发酵周期，提高设备利用率 产品容易分离纯化 适用于胞外酶等胞外产物的生产
（二）固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制
同，进行光照的调节控制； 前体的添加：目的代谢物代谢途径上游的物质。 刺激剂的应用：常用的刺激剂有微生物细胞的碎片和果胶酶、
《酶工程》课件-微生物发酵产酶
05
微生物发酵产酶存在问题与挑战
产量问题
微生物发酵产酶产量低
由于微生物发酵过程中受到多种因素 的影响，如营养物质的供应、发酵条 件、微生物菌种等，导致酶的产量较 低。
发酵周期长
微生物发酵产酶通常需要较长的发酵 周期，这增加了生产成本和时间成本。
稳定性问题
酶稳定性差
许多酶在发酵过程中容易受到温度、pH值、金属离子等因素的影响，导致酶的稳定性降低。
04
微生物发酵产酶应用实例
工业应用
洗涤剂制造
微生物发酵产生的酶可用于制造 洗涤剂，如蛋白酶用于去除蛋白 质污渍，淀粉酶用于去除淀粉污
渍。
纺织工业
利用微生物发酵产生的酶处理纺织 品，可以改善其质地、手感和外观， 如纤维素酶用于棉织物的生物抛光。
造纸工业
通过微生物发酵产酶技术，可以改 进造纸工艺，提高纸张质量和降低 环境污染，如木聚糖酶用于纸浆漂 白。
过程优化与控制
通过人工智能技术，对微生物发酵产酶过程进行建模和优化，提高 目标酶的产量和质量。
个性化定制酶
结合人工智能和基因工程技术，实现个性化定制酶的合成，满足不 同领域的需求。
THANKS
感谢观看
《酶工程》课件-微生物发酵 产酶
• 微生物发酵产酶概述 • 微生物发酵产酶原理与过程 • 微生物发酵产酶技术与方法
• 微生物发酵产酶应用实例 • 微生物发酵产酶存在问题与挑战 • 未来发展趋势与展望
01
微生物发酵产酶概述
酶工程简介
酶工程定义
酶工程是生物工程的重要组成部分，是利用酶或者微生物细胞、动植物细胞、 细胞器等具有的生物催化功能，借助工程手段来生产有用物质、设计改造酶或 者生产细胞、器官乃至整个生物体的一门科学技术。
酶的生产培训知识
代谢产物
代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋 白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达
3.分解代谢物阻遏
指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮 源）存在时，利用快的那种分解底物会阻 遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。
分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利 用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通 过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所 产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。
木瓜细胞培养生产木瓜蛋白酶和木瓜 凝乳蛋白酶 人黑色素瘤细胞培养生 产血纤维蛋白溶酶原激活剂
动植物细胞培养的特殊性：
1、细胞比微生物细胞大得多，体积大几 千倍，
2、对剪切力敏感，动物细胞没有细胞壁 更甚
3、生长速率比微生物低，生长倍增时间 和发酵周期均更长，
4、对营养的要求较微生物复杂，动物细 胞往往需要添加血清和其他营养成分
（1）不是致病菌及产生有毒物质或其他 生理活生物质的微生物，确保酶生产和 应用的安全。
（2）能在便宜的底物上生长良好，繁殖 快，产酶量高，有利于缩短生周期
（3）产酶性能稳定，菌株不易退化，不 易受噬菌体侵袭。
（4）目标酶的产量要高，性能符合应用 需要，产生的酶容易分离纯化，最好为 胞外酶。
（5）除蛋白酶生产菌种外，其他酶等胞外产物的生产
第三章 酶的生产和制备
第五节 酶的分离纯化（酶的制备）
酶的提取和分离纯化： 将酶从细胞或培养基中抽提出来，
获得与使用目的相适应的有一定纯度 和浓度的酶产品的过程。
两个基本环节：分离和纯化
分离：将酶从原料中抽提出来，并尽可能少 引入杂质，得到粗酶液
纯化：将酶和杂质中分离开来，或者有选择 地将酶从包含杂质中分离出来，得到一定纯 度的酶。
IPTG/乳糖 纤维素/纤维二糖诱导纤 维素酶
第三章 酶的发酵生产
三 动植物细胞培养缺点 动植物细胞体积大、对剪切力敏感， 动植物细胞体积大 、 对剪切力敏感 ， 要求特殊生 物反应器。 物反应器。 动植物细胞生长速率、代谢速率低，发酵周期长， 动植物细胞生长速率 、 代谢速率低 ， 发酵周期长 ， 对防止杂菌污染的技术要求高。 对防止杂菌污染的技术要求高。 动物细胞营养要求苛刻. 动物细胞营养要求苛刻
应用实例 在利用嗜热芽孢杆菌生产α-淀粉酶时 淀粉酶时,采用甘油替 在利用嗜热芽孢杆菌生产 淀粉酶时 采用甘油替 代果糖解除分解代谢物阻遏,可以使产量提高 可以使产量提高25 代果糖解除分解代谢物阻遏 可以使产量提高 倍. 某些商业酶的诱导 酶 α-淀粉酶 淀粉酶 葡萄糖淀粉酶 转化酶 普鲁兰酶 木糖异构酶 底物 淀粉 淀粉 蔗糖 普鲁兰 木糖 诱导 淀粉或麦芽糊精
酶的生产方法 酶的生产方法
提取分离法
生物合成
化学合成
SOD-BLOOD Papain-Papaya Chymotrypsin-Pancrea
Amylase from B.subtilis Protease from B.subtilis Phosphatase from B.subtilis Glucoamylase from Aspergillus Plant cell Animal cell
二 不同类型、植物、动物细胞的特性比较 不同类型、植物、
微生物细胞 细菌 细胞大小 (µm) 025～1 ～ 倍增时间(hr) 倍增时间 营养要求 细胞壁 对剪切力 主要产物 酵母 1～10 ～ 1.15～ ～ 2 简单 有 大多不敏感 醇、有机酸、氨基酸、核苷 有机酸、氨基酸、 抗生素、 多糖、 酸、抗生素、酶、多糖、色 素、菌体 2～6.9 ～ 霉菌 20～300 ～ 20～74 ～ 较简单 有，坚硬 敏感 色素、 色素、香 精、药物 10～100 ～ 15～100 ～ 复杂 无 很敏感 激素、 激素、疫 苗、单克 隆抗体 植物细胞 动物细胞
酶工程 第三章酶的发酵生产 第二节酶发酵生产常用的微生物
第二节 酶发酵生产常用的微生物
十、啤酒酵母（Sacharomycescerevisiae）
啤酒酵母是在工业上广泛应用的酵母，细胞由圆形、 卵形、椭圆形到腊肠形。在麦芽汁琼脂培养基上菌落为白 色，有光泽，平滑，边缘整齐。营养细胞可以直接变为子 囊，每个子囊含有1—4个圆形光亮的子囊孢子。
啤酒酵母主要用于酿造啤酒、酒精、饮料酒和面包制 造。在酶的生产方面，用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱 氢酶等的生产。
酶的发酵生产是以获得大量所需的酶为目的。为此， 除了选择性能优良的产酶细胞以外，还必须满足细胞生长、 繁殖和发酵产酶的各种工艺条件，并要根据发酵过程的变 化进行优化控制。
酶发酵生产的一般工艺流程如图3-6所示。
酶工程
第三章 酶的发酵生产
第二节 酶发酵生产常用的微生物
任何生物都能在一定条件下合成某些酶。但是并不是 所有的细胞都能用于酶的发酵生产。一般说来，能用于酶 发酵生产的细胞必需具备如下几个条件：（1）酶的产量 高。优良的产酶细胞首先要具有高产的特性，才有较好的 开发应用价值。高产细胞可以通过筛选、诱变、或采用基 因工程、细胞工程等技术而获得。（2）容易培养和管理。 要求产酶细胞容易生长繁殖，并且适应性较强，易于控制 便于管理。（3）产酶稳定性好。在通常的生产条件下， 能够稳定地用于生产，不易退化。一旦细胞退化，要经过 复壮处理，使其恢复产酶性能。（4）利于酶的分离纯化。 发酵完成后，需经分离纯化过程，才能得到所需的酶。这 就要求产酶细胞本身及其它杂质易于和酶分离。（5）安 全可靠。要求使用的细胞及其代谢物安全无毒，不会影响 生产人员和环境，也不会对酶的应用产生其他不良影响。
第二节 酶发酵生产常用的微生物
二、大肠杆菌（Escherichia coli）
【发酵工程】第三章 发酵培养基3
灭菌
在大规模发酵中应该尽可能的采取连续灭菌的操作， 而且保证灭菌条件的稳定是保证发酵稳定的前提 有时避免营养物质在加热的条件下，相互作用， 可以将营养物质分开消毒。 Na2HPO4+CaCO3→CaHPO4+Na2CO3 有些物质由于挥发和对热非常敏感，就不能采用湿 热的灭菌方法
第四节、重组产品培养基的介绍
13．在实验中我们所用到的淀粉水解培养基是一种（ ） 培养基 A 基础培养基 B加富培养基 C选择培养基 D鉴别培养基
15.要从多种细菌中分离某种细菌，培养基要用（ ）
A.加入青霉素的培养基 B．加入高浓度食盐的培
养基 C．固体培养基
D.液体培养基
C
16．根据培养基的物理状态，划分的发酵种类
是
（
）
第一节第一节发酵培养基的要求和种类发酵培养基的要求和种类第二节第二节发酵培养基的成分及来源发酵培养基的成分及来源第三节第三节发酵培养基的设计原理与优化发酵培养基的设计原理与优化第二节发酵培养基的成分及来源一碳源1作用2来源有机氮源和无机氮源二氮源1作用2来源三无机盐及微量元素糖类油脂有机酸烃和醇类四生长因子前体和产物促进剂从广义上讲凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质如氨基酸嘌呤嘧啶维生素等均称生长因子
pH控制摇床：反应器水平上的摇瓶研究
五、培养基设计时注意的一些相关问题
原料及设备的预处理 原材料的质量
发酵特性的影响
在抗生素发酵生产中往往喜欢所谓的“稀配方”，因 为它既降低成本、灭菌容易、且使氧传递容易而有利 于目的产物的生物合成。如果营养成分缺乏，则可通 过中间补料方法予以弥补。
单因子实验
多因子实验：均匀设计、
正交实验设计、 响应面分析等。
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武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
新开发的酶必须按规定进行下表的各项检查
项目
试验动物
急性中毒
鼠,大白鼠
口服 4周
大白鼠
12月
狗
致癌试验:24月
两重啮齿动物
畸胚组织发生试验(24月) 两重啮齿动物
生产病原性试验
四种动物
皮肤刺激性试验(肤,眼) 兔子,人
抗原性
人
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
2、固体培养发酵
培养基以麸皮、米糠等为主要原料，经灭菌后，接入产酶菌 株，在一定条件下发酵。
3、固定化细胞发酵（70年代后期发展）
将细胞固定在载体上后，进行发酵生产。
4、固定化原生质体发酵（80年代中期发展）
原生质体是指除去了细胞壁的微生物细胞或植物细胞。
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第二节 酶生物合成的基本理论
（二）、常用的产酶微生物
1、细菌
大肠杆菌 谷氨酸脱羧酶、天冬氨
酸酶、青霉素酰化酶、天冬 酰胺酶、β -半乳糖苷酶、限 制性核酸内切酶、DNA聚合酶、 DNA连接酶、核酸外切酶等。
枯草杆菌 α -淀粉酶、蛋白酶、 β -葡聚糖酶、5‘-核苷酸酶、碱
性磷酸酶。
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2、放线菌
米曲霉，黑曲霉， 制造葡萄糖，发酵、酿酒等
葡萄糖淀粉酶
米根霉
工业的淀粉水解糖
中性蛋白酶
枯草芽胞杆菌，米 曲霉
皮革、毛皮加工，食品加工， 调味品制造、助消化、消炎、
啤酒澄清
碱性蛋白酶
地衣芽胞杆菌
加酶洗涤剂
植酸酶
黑曲霉，毕赤酵母 工程菌株
饲料添加剂
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
酶合成的基因调控类型：诱导和阻遏
1、酶合成的诱导作用
加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为 诱导作用。
诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物。
例：乳糖诱导ß-半乳糖苷酶的合成 淀粉诱导a-淀粉酶的合成
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乳品工业（处理牛乳和乳清）
果胶酶
曲霉、欧文氏菌
水果加工，果汁、果酒澄清， 麻类纤维脱胶
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工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源
转化酶 啤酒酵母、假丝酵母 制造转化糖
凝乳酶
脂肪酶
葡萄糖氧 化酶
葡萄糖异 构酶
青霉素酰 化酶
米赫毛霉,大肠杆菌和真 菌生产的重组酶
制造乳酪
链霉菌：葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、纤维素酶、碱 性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。
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3、霉菌
黑曲霉：糖化酶、α -淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡 萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、橙皮苷酶等。
米曲霉：氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等。 红曲霉：α -淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。 青霉：葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶、纤维素酶 等。 木霉：纤维素酶。 根霉：糖化酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶，脂肪酶、果胶酶、 纤维素酶、半纤维素酶等。 毛霉：蛋白酶、糖化酶、α -淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、 凝乳酶等。
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2、筛选 由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进
行分离筛选 。
产酶菌种筛选步骤：
（1）样品的采集：主要是各种富含所需微生物的土壤、水、 气、枯枝烂叶、烂水果等 ；
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（2）初筛：分离产目的酶的菌株； 给予特殊的培养基或培养条件，进而让目的菌株得以繁殖，
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第一节 酶的生产方法牛胃→凝乳酶
一、酶的生产方法
胰脏→胰酶 血液→凝血酶
1、提取法
木瓜→木瓜蛋白酶
采用各种技术，直接从动、植物细胞或组织中将
酶提取出来。提取法虽简单易行，但受原材料来源的 限制。
2、化学合成法
是20世纪60年代中期出现的新技术。
只能合成那些已知化学结构的酶；成本比较高。
保藏菌种
试管斜面培养（活化）
培养基
摇瓶扩大培养 种子罐培养 发酵罐
无菌空气
分离纯化
酶
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二、酶生产菌种 （一）产酶菌种的要求
（1）产酶量高； （2）繁殖快，发酵周期短； （3）产酶稳定性好，不易退化，不易被感染； （4）能够利用廉价原料，容易培养和管理；
（5）安全性可靠，非致病菌。
第一节 酶的生产方法
1894年，美籍日人高峰让吉首先从米曲霉中制备 得到高峰淀粉酶（ａ-淀粉酶、他卡酶），用作消化 剂，开创了近代酶的生产和应用的先例。 1908年，德国的罗姆（Rohm）用动物胰脏制得胰 酶，用于皮革的软化。 1908年，法国的波伊定（Boidin）制备得到细菌 淀粉酶，用于纺织品的退浆；
1911年，华勒斯坦（Wallerstein）从木瓜中获得 木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清。
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1949年，日本开始采用微生物液体深层培养方法 进行细菌ａ-淀粉酶的发酵生产，揭开了现代酶制剂 工业的序幕。 20世纪80年代发展起来的动、植物细胞培养技术， 继微生物发酵生产酶之后，已成为酶生产的又一种途 径。
第二章 酶的微生物发酵生产
本章主要内容：
酶的生产方法； 酶生物合成的基本理论； 发酵产酶的工艺条件及控制； 酶发酵动力学； 固定化细胞和原生质体发酵产酶．
重点： 酶生物合成的基本理论； 微生物发酵产酶工艺。
难点：
酶生物合成的诱导和阻遏；
发酵过程细胞生长与酶合成之 间的关系。
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纤维素酶
里氏木霉、黑曲霉
水洗布生产，饲料添加剂， 消化植物细胞壁
半纤维素 酶
木霉、曲霉、根霉பைடு நூலகம்
饲料添加剂，消化植物细胞 壁，低聚木糖生产
β-葡聚糖 酶
异淀粉酶
枯草芽胞杆菌，黑曲 霉，Penicillium emersonii
产气克雷伯氏菌，芽 孢杆菌
啤酒酿造，饲料添加剂 淀粉加工
乳糖酶
乳酸酵母，米曲霉， 黑曲霉，米根霉
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扩大培养应注意的事项： （1）尽量减少传代次数，以降低菌种衰退和污染的可能性； （2）培养基成分一般应比发酵培养基的氮源丰富； （3）培养时间一般控制在微生物生长的对数生长期，及时接 入下一级培养或发酵罐； （4）严格控制培养条件（pH、温度、通气量等），加强培 养过程的实时监测。
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4、酵母
啤酒酵母：丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等。 假丝酵母：脂肪酶、尿酸酶、尿囊酸酶、转化酶、醇脱氢 酶等。
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工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源
酶 α-淀粉酶
产酶微生物
枯草芽胞杆菌 地衣芽胞杆菌
米曲霉
用途
淀粉液化，织物退浆，消化 助剂，加酶洗涤剂
曲霉、根霉、酵母等
加酶洗涤剂，油脂加工， 生物化工
青霉、曲霉
食品去氧、除葡萄糖，测 定葡萄糖
凝结芽胞杆菌，白色链 霉菌
生产果葡糖浆
细菌、霉菌、放线菌 制造6-氨基青霉烷酸
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（三 ）生产菌种的来源
1、买，专利 向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。
中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）； 中国典型培养物保藏中心（CCTCC，又称武大保藏中心）。 中国农业微生物菌种保藏中心（ACCC）； 中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC） 美国典型微生物菌种保藏中心（ATCC） 荷兰微生物菌种保藏中心（CBS） 德国微生物菌种保藏中心（DSMZ） 英国国家典型菌种保藏所（NCTC）
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第三节 微生物发酵产酶工艺（重点）
发酵法生产酶制剂，就是给酶的生产菌种提供适当的营养 和生长环境，使生产菌大量增殖，同时合成所需要的酶，然后 由发酵所得物料制成酶产品。
现代酶制剂的大规模生产以深层液体发酵法为主。
一、发酵产酶的一般工艺流程
3、无机盐：大量元素和微量元素。 基本功能：构成细胞的成分； 构成酶产品的组分； 作为酶的激活剂。
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4、生长因子
指微生物生长繁殖所必不可缺的微量有机物，主要包括各 种氨基酸、嘌呤或嘧啶、维生素等三类物质。
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（1 ）菌种活化
目的：保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接 种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下培养，以 恢复细胞的生命活动能力。
方法：在试管斜面上培养1-3代。
（2 ）扩大培养
目的：活化后的菌种经过一级至数级的扩大培养， 以获得足够数量的优质细胞。
培养基称为种子培养基。 方法：分为实验室培养和车间培养两个阶段。
注意：在选择碳源时，应尽量选择对所需酶有诱导作用的 碳源，而不使用或少使用有分解代谢物阻遏作用的碳源。
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2、氮源：提供氮元素。 来源：①有机氮：常利用农副产品的籽实榨油后的
副产品，如豆饼、花生饼、菜子饼等； ②无机氮：含氮的无机化合物，如（NH4）2SO4、
NH4NO3 、NaNO3和（NH4）3PO4等。
尽可能地把只成为目的菌的菌株分离出来。
-淀粉酶的筛选
蛋白酶的筛选
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新开发的酶必须按规定进行下表的各项检查
项目
试验动物
急性中毒
鼠,大白鼠
口服 4周
大白鼠
12月
狗
致癌试验:24月
两重啮齿动物
畸胚组织发生试验(24月) 两重啮齿动物
生产病原性试验
四种动物
皮肤刺激性试验(肤,眼) 兔子,人
抗原性
人
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2、固体培养发酵
培养基以麸皮、米糠等为主要原料，经灭菌后，接入产酶菌 株，在一定条件下发酵。
3、固定化细胞发酵（70年代后期发展）
将细胞固定在载体上后，进行发酵生产。
4、固定化原生质体发酵（80年代中期发展）
原生质体是指除去了细胞壁的微生物细胞或植物细胞。
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第二节 酶生物合成的基本理论
（二）、常用的产酶微生物
1、细菌
大肠杆菌 谷氨酸脱羧酶、天冬氨
酸酶、青霉素酰化酶、天冬 酰胺酶、β -半乳糖苷酶、限 制性核酸内切酶、DNA聚合酶、 DNA连接酶、核酸外切酶等。
枯草杆菌 α -淀粉酶、蛋白酶、 β -葡聚糖酶、5‘-核苷酸酶、碱
性磷酸酶。
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2、放线菌
米曲霉，黑曲霉， 制造葡萄糖，发酵、酿酒等
葡萄糖淀粉酶
米根霉
工业的淀粉水解糖
中性蛋白酶
枯草芽胞杆菌，米 曲霉
皮革、毛皮加工，食品加工， 调味品制造、助消化、消炎、
啤酒澄清
碱性蛋白酶
地衣芽胞杆菌
加酶洗涤剂
植酸酶
黑曲霉，毕赤酵母 工程菌株
饲料添加剂
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工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源
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酶合成的基因调控类型：诱导和阻遏
1、酶合成的诱导作用
加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为 诱导作用。
诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物。
例：乳糖诱导ß-半乳糖苷酶的合成 淀粉诱导a-淀粉酶的合成
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乳品工业（处理牛乳和乳清）
果胶酶
曲霉、欧文氏菌
水果加工，果汁、果酒澄清， 麻类纤维脱胶
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工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源
转化酶 啤酒酵母、假丝酵母 制造转化糖
凝乳酶
脂肪酶
葡萄糖氧 化酶
葡萄糖异 构酶
青霉素酰 化酶
米赫毛霉,大肠杆菌和真 菌生产的重组酶
制造乳酪
链霉菌：葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、纤维素酶、碱 性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。
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3、霉菌
黑曲霉：糖化酶、α -淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡 萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、橙皮苷酶等。
米曲霉：氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等。 红曲霉：α -淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。 青霉：葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶、纤维素酶 等。 木霉：纤维素酶。 根霉：糖化酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶，脂肪酶、果胶酶、 纤维素酶、半纤维素酶等。 毛霉：蛋白酶、糖化酶、α -淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、 凝乳酶等。
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2、筛选 由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进
行分离筛选 。
产酶菌种筛选步骤：
（1）样品的采集：主要是各种富含所需微生物的土壤、水、 气、枯枝烂叶、烂水果等 ；
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（2）初筛：分离产目的酶的菌株； 给予特殊的培养基或培养条件，进而让目的菌株得以繁殖，
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第一节 酶的生产方法牛胃→凝乳酶
一、酶的生产方法
胰脏→胰酶 血液→凝血酶
1、提取法
木瓜→木瓜蛋白酶
采用各种技术，直接从动、植物细胞或组织中将
酶提取出来。提取法虽简单易行，但受原材料来源的 限制。
2、化学合成法
是20世纪60年代中期出现的新技术。
只能合成那些已知化学结构的酶；成本比较高。
保藏菌种
试管斜面培养（活化）
培养基
摇瓶扩大培养 种子罐培养 发酵罐
无菌空气
分离纯化
酶
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二、酶生产菌种 （一）产酶菌种的要求
（1）产酶量高； （2）繁殖快，发酵周期短； （3）产酶稳定性好，不易退化，不易被感染； （4）能够利用廉价原料，容易培养和管理；
（5）安全性可靠，非致病菌。
第一节 酶的生产方法
1894年，美籍日人高峰让吉首先从米曲霉中制备 得到高峰淀粉酶（ａ-淀粉酶、他卡酶），用作消化 剂，开创了近代酶的生产和应用的先例。 1908年，德国的罗姆（Rohm）用动物胰脏制得胰 酶，用于皮革的软化。 1908年，法国的波伊定（Boidin）制备得到细菌 淀粉酶，用于纺织品的退浆；
1911年，华勒斯坦（Wallerstein）从木瓜中获得 木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清。
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1949年，日本开始采用微生物液体深层培养方法 进行细菌ａ-淀粉酶的发酵生产，揭开了现代酶制剂 工业的序幕。 20世纪80年代发展起来的动、植物细胞培养技术， 继微生物发酵生产酶之后，已成为酶生产的又一种途 径。
第二章 酶的微生物发酵生产
本章主要内容：
酶的生产方法； 酶生物合成的基本理论； 发酵产酶的工艺条件及控制； 酶发酵动力学； 固定化细胞和原生质体发酵产酶．
重点： 酶生物合成的基本理论； 微生物发酵产酶工艺。
难点：
酶生物合成的诱导和阻遏；
发酵过程细胞生长与酶合成之 间的关系。
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纤维素酶
里氏木霉、黑曲霉
水洗布生产，饲料添加剂， 消化植物细胞壁
半纤维素 酶
木霉、曲霉、根霉பைடு நூலகம்
饲料添加剂，消化植物细胞 壁，低聚木糖生产
β-葡聚糖 酶
异淀粉酶
枯草芽胞杆菌，黑曲 霉，Penicillium emersonii
产气克雷伯氏菌，芽 孢杆菌
啤酒酿造，饲料添加剂 淀粉加工
乳糖酶
乳酸酵母，米曲霉， 黑曲霉，米根霉
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扩大培养应注意的事项： （1）尽量减少传代次数，以降低菌种衰退和污染的可能性； （2）培养基成分一般应比发酵培养基的氮源丰富； （3）培养时间一般控制在微生物生长的对数生长期，及时接 入下一级培养或发酵罐； （4）严格控制培养条件（pH、温度、通气量等），加强培 养过程的实时监测。
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4、酵母
啤酒酵母：丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等。 假丝酵母：脂肪酶、尿酸酶、尿囊酸酶、转化酶、醇脱氢 酶等。
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工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源
酶 α-淀粉酶
产酶微生物
枯草芽胞杆菌 地衣芽胞杆菌
米曲霉
用途
淀粉液化，织物退浆，消化 助剂，加酶洗涤剂
曲霉、根霉、酵母等
加酶洗涤剂，油脂加工， 生物化工
青霉、曲霉
食品去氧、除葡萄糖，测 定葡萄糖
凝结芽胞杆菌，白色链 霉菌
生产果葡糖浆
细菌、霉菌、放线菌 制造6-氨基青霉烷酸
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（三 ）生产菌种的来源
1、买，专利 向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。
中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）； 中国典型培养物保藏中心（CCTCC，又称武大保藏中心）。 中国农业微生物菌种保藏中心（ACCC）； 中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC） 美国典型微生物菌种保藏中心（ATCC） 荷兰微生物菌种保藏中心（CBS） 德国微生物菌种保藏中心（DSMZ） 英国国家典型菌种保藏所（NCTC）
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第三节 微生物发酵产酶工艺（重点）
发酵法生产酶制剂，就是给酶的生产菌种提供适当的营养 和生长环境，使生产菌大量增殖，同时合成所需要的酶，然后 由发酵所得物料制成酶产品。
现代酶制剂的大规模生产以深层液体发酵法为主。
一、发酵产酶的一般工艺流程
3、无机盐：大量元素和微量元素。 基本功能：构成细胞的成分； 构成酶产品的组分； 作为酶的激活剂。
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4、生长因子
指微生物生长繁殖所必不可缺的微量有机物，主要包括各 种氨基酸、嘌呤或嘧啶、维生素等三类物质。
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（1 ）菌种活化
目的：保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接 种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下培养，以 恢复细胞的生命活动能力。
方法：在试管斜面上培养1-3代。
（2 ）扩大培养
目的：活化后的菌种经过一级至数级的扩大培养， 以获得足够数量的优质细胞。
培养基称为种子培养基。 方法：分为实验室培养和车间培养两个阶段。
注意：在选择碳源时，应尽量选择对所需酶有诱导作用的 碳源，而不使用或少使用有分解代谢物阻遏作用的碳源。
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2、氮源：提供氮元素。 来源：①有机氮：常利用农副产品的籽实榨油后的
副产品，如豆饼、花生饼、菜子饼等； ②无机氮：含氮的无机化合物，如（NH4）2SO4、
NH4NO3 、NaNO3和（NH4）3PO4等。
尽可能地把只成为目的菌的菌株分离出来。
-淀粉酶的筛选
蛋白酶的筛选
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