色谱技术答案

1若想建立某中药的醇提液的RPHPLC 指纹图谱，是采用等度洗脱还是梯度洗脱？简述其分析条件的优化。

答：1系统梯度洗脱

由于中药的醇体液成分复杂，样品的K （容量因子）范围宽，不能用等度洗脱，梯度洗脱可以使不同K 值的样品成分洗脱时随流动相的连续改变而趋于同一K 值，谱峰尖锐而对称，分离度改善，缩短分离时间，降低最小检测量和提高分离精度，从而让所有成分均出峰

2．优化思路：

梯度期间，强溶剂的浓度B%增大，优化梯度条件起始B%，终止B%，梯度时间t 和溶剂B 的种类，因此在RPHPLC 指纹图谱建立时，考虑流动相种类，流动梯度范围和梯度斜率三方面。

（1） 流动相种类的选择：RPHPLC 中常用甲醇，乙腈，四氢呋喃等有机溶剂与水混合，流动相种类由样品分离

难易程度决定。MeoH 、CAN 、THF 洗脱强度逐渐增高，样品易分离时采用溶剂优化法选择流动相和水的

最佳比例，调整K 值，使其在1—20(t R :3—35min).

（2） 梯度范围：即起始和终止B%一般为5%--100%（t R ：30min ）若谱图前段空白可提高初始B%，末端空白需

降低终止浓度，可节省时间缩小梯度范围使所有组分短时间从柱中洗脱出来

（3） 梯度斜率：根据初步分离的谱图，峰密集部位可降低斜率，减小强溶剂B%变化速度，峰疏散部分提高梯

度斜率，时间短

2，根据Van deemter f 方程在液相色谱中的表现形式，分析在HPLC 中影响柱效的因素及实验条件的选择。

答：Van Deemter 方程在液相色谱中表现形式为:

(1) 影响柱效的因素：

a. 涡流扩散项：为避免涡流扩散而引起的峰扩张，需用小而均匀颗粒填充颜色等等

b. 纵向扩散项：HPLC 中Dm 仅有Gc 的10-4—10-5倍，该项系忽略。

c. 固定相传质阻力项：降低固定液膜厚度，加快组分在固定相中的扩散

d. 流动相传质阻力项：组分分子随流动相进入色谱柱时，靠近固定相颗粒的部分分子流速较慢，中央分子流速较

快，而引起峰扩张，要降低该项需减小dp 和u ，增大Dm.

e. 流动相滞留传质项：固定相的多孔性使部分流动相滞留于固定相某一局部，流动相中组分分子必须自流动相扩

散到滞留区，才能与固定相进行质量交换，为降低该项，应采用颗粒小，微孔浅，孔径大的固定相。

（2）选择实验条件以提高柱效：

减小填料孔穴深度，减小填料粒度；用低粒度溶剂做流动剂，流动相采用低流速；适当提高柱温。

3、分析影响分离度的因素及提高分离度的措施

答：分离度是衡量分离效果的指标，基本分离方程：

分离度受动力学和热力学因素两方面的影响，因素有：效率因子n ，选择性因子α，容量因子k ’。

1） n ：当固定相确定后，要使分离达到某一分离度，柱必须有最低限度的理论搭班数，增加柱长，减小柱H 均可提高

分离度。

2） α越大，柱选择性越好，α微变是R 有较大变化，α∝1时，更为显著。Α的增加对提高分离度最有效，可通过改

变固定相、流动相、柱温、样品结构一衍生化，使α变大提高分离度。

3） k ’：R 正比于 ，在填充柱GC 中，R 较大，k ’对R 影响可忽略。在液相色谱中，由于固定相对于流动相体积而言

很小，溶质在固定相种的量亦很小，当k ’增大时，R 也迅速增加，k ’可通过控制溶剂极性大小来调节。

2、提高分离度的措施：

1）改变流动相的组成：增加α。

2）改变流动相的PH ：限用于样品为能电离的酸或碱。

3）改变固定相：因需换色谱柱、流动相，使k ’、α在合适范围内不方便。

4）改变分离温度：升高温度，k ’值减小，可减小溶剂洗脱能力来抵消此效应。

5）采用各种配位反应：提高分离的选择性。

4 影响薄层展开的因素有那些类型？如何影响的？

１．相对湿度 展开时，最佳相对湿度范围决定于溶质和溶剂的极性，随溶质、溶剂极性的增加，相对湿度范围也增大。 因为展开室中展开剂蒸气分子有取代吸附在薄层上的水分子的趋势，取代量决定于展开剂蒸气的极性和量；展开剂蒸()u D

df k k u D dp u C u B A H s m s ⋅⋅+++=++=2

2

132/22/γλ

气分子极性越大，越易取代吸附的水分子，使原吸附的水分下降，使薄层上吸附的水蒸气的影响越小。

２．溶剂蒸气的影响① 展开室饱和有以下情况A ．展开室饱和：展开剂蒸气在展开室中达到平衡B ．预吸附：薄层板干燥板面对展开室气体分子的吸附C ．吸附饱和：薄层板干燥板面与展开室饱和气体空间达到平衡D ．毛细管饱和：薄层板所有的自由空隙借毛细管作用被溶剂充满的过程，即相当于展开后薄层的状态 ②“边缘效应”薄层边缘处低极性溶剂挥发快，因此边缘部分的展开剂中极性溶剂的比例增大，R f 值相应增大③“脱混”、“双前沿”

未饱和展开时，吸附剂对多元展开剂的亲和力不同，∴展开剂的上升速度不同（亲和力A>B>C ，则Rf 值A

３．温度的影响温度对纸色谱影响较大 对TLC 影响较小

４．展距的影响∴PC ：20～30cm ；TLC ：10～20cm ； HPTLC ：5～10cm

５．展开室的放置 水平、稳定、避免阳光直射，不要通风，离开热源，光敏物质的分离要置于暗处

5GC 程序升温

对于宽沸程的样品——程序升温(单阶程序升温、多阶程序升温)在分析过程中柱温随时间而变化，通常是升高柱温。它的优点是： 减少分析时间， 整个分离过程中峰形一致, 检测和测定更容易。缺点：样品组分将经历比恒温分离更高的温度这可能会导致某些敏感组分降解，在两次进样之间柱温箱必须冷却到初始温度这样就抵消了部分所节省的分析时间。

初始温度、初始时间、升温速率、终止温度、终止时间

程序升温（1 ）升温方式 单阶：沸点范围宽的同系物 多阶：复杂样品（2）初温程序升温中初温的选择依据是： ① 样品组分的挥发性，一般初温选择低于样品中主要挥发组分的沸点温度； ② 固定相的粘度，初温应高于固定相的凝固温度。对于未知样品，一般初温可选用室温。③太低：t 长 太高：分离度↓ （3）终温 在程序升温分析时终温主要依据下述两点来进行选择：① 样品的稳定性， ② 高沸点组分的保留温度和固定液的最高使用温度 。（4）升温速率

升温速率快：分离度降低，分析时间缩短。填充柱：d 3 ～5mm ，L 2 ～3m ， r=3 ～10℃/min 毛细管柱：0.25mm 25 ～50m r=0.5 ～4℃/min

6请简述影响HPCE 峰面积重现性的因素及其解决办法

1.纵向扩散的影响 纵向扩散引起的峰展宽，σ2等于2Dt ,由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。

2.进样的影响 当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度：W inj = (24D t )1/2。实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%～2%。 因素 起因 解决方法

温度变化 粘度和进样量的变化 使用可调节温度的毛细管

样品蒸发 样品浓度提高 用带盖的小瓶或冷却自动进样器

仪器的局限性 没有足够的数据采集率 延长进样时间

样品夹带物 进样量大 使用平整、光滑的进样毛细管；将毛细管末端的聚酰亚胺除掉；进样后在缓冲溶液中或水中浸毛细管 浸在样品中的毛细管引起的零进样 进样量大 不能消除但可以量化 样品吸附在毛细管壁上 峰形扭曲；非洗脱样品 改变缓冲液的PH 值；增加缓冲液的浓度；使用涂层毛细管 低信噪比 积分错误 优化积分参数；增加样品浓度；使用峰高 高压的出现 缓冲液的热膨胀和样品排出 斜坡分离电压 电动进样 样品基质的变化 使用流体力学进样