细菌内毒素检测方法

细菌内毒素检测方法

（译自英国药典BP2004版，等同欧洲药典EP5版。见原文之附录XIV A 方法2.6.14.）

本文所描述的五种方法用于检测产品中是否存在细菌内毒素，而这些方法适用于药典中的细菌内毒素的检查法--限度试验.方法的制定者希望弄清楚，如在生产中能否降低其产品中的内毒素的含量，本篇幅中有关使用这些测试的相关方法将在补充的附录被提供。

细菌内毒素的检测原理是利用鲎变形细胞的溶解物来进行的（ＬＡＬ试验）。将含内毒素的溶液加入鲎变形细胞的溶解物可产生浑浊、沉淀或混合物的凝胶化反应。反应速度依赖于溶液中的内毒素的浓度、pH和温度；反应要求有一定量的二价阳离子、一个原凝酶系和可溶性蛋白的创造，而这些都哪由鲎变形细胞的溶解物提供。采用从染色基因肽中释放的染料浓度来进行测定样品的内毒素浓度。

下面五种方法将在后面文章中介绍；

方法A：凝胶法；限度试验

方法B：半定量凝胶法

方法C：动力学浑浊法

方法D：动力学发色肽方法

方法E：发色肽终点法

当一篇专门文献中介绍内毒素的测定而没有指明某一种方法时，那么测试的方法就是按照方法A 。次种方法已经得到证实，否则，产品的有效检测将会在专门文献中特别提到。

很多专著以“细菌内毒素限定浓度”的概念给出了细菌内毒素指标，也即某种产品所含细菌内毒素浓度不能超过限定浓度，要想证明产品符合要求，就必须表明产品所含内毒素的含量是少于内毒素限定浓度的。

试验是利用一种能避免微生物污染的方式进行的。

检测前的准备工作中，必须证实如下内容：

——所以的设备器皿不吸附内毒素。

——溶解物的灵敏度λ，λ是被定义为标记的溶解物敏感度或者最低内毒素浓度被用于制作标准曲线的（定量法）。

——干扰素的排除；

如有必要时，需对设备和器具进行处理，以减少其本身所带内毒素。

除非特别指明外，否则在文献中从方法A到E中均采用相同标准。

在本篇附录中，术语说明中包括任何其他的容器，诸如一个微滴定率的极板等。

本试验包括如下试剂和标准溶液制备：

标准细菌内毒素BRP；与国际标准相比较，对标准内毒素BRP进行效准，并以国际标准单位来表示。

鲎变形细胞溶解物：按标签所述浓度的原标准溶解物，对每一批来讲，都要按“溶解物敏感度”中所述来确定其固有敏感度。溶解物敏感度定义为在实验条件下能产生硬性凝胶时细菌内毒素的最低浓度，并以内毒素单位IU/ML来表示。

LAL水：如果在规定的内毒素检测实验条件下，能给出一个阳性结果，那么这种水是合格的。利用一种能有效防止夹带水滴的装置将水蒸馏三次，就可得到合格的LAL水，也可以利用其它方法制备符合要求的水。

0.1m的LAL与盐酸和0.1M的氢氧化钠溶液，用盐酸和氢氧化钠试剂均用LAL水来制备的，每种试剂都调制pH6.0~8.0时，在实验条件下能给出阴性结果为合格。

除非有其它规定，实验所用溶液及稀释液皆须用LAL水来配置。

凝胶法

方法A和B都是使用在与溶液物混合后存在潜伏细菌内毒素的溶液中形成凝胶的形式，这两种方法要求溶解物敏感度在其影响被确定因素后测定的。

方法A和B在是否包含比内毒素限定浓度更少的因素方面是不同的。方法A 测试的是待测样品的复制溶液中所含内毒素比在有关指定专著中的内毒素限定

浓度少，而方法B中待检测样品中的内毒素含量被确定为半定量，而几何学平均内毒素浓度必须是少于被指定在专著中的内毒素限定浓度。

在如下文章中，溶解物敏感度和干扰因素适用于方法A和方法B。

步骤：取一定数量的器皿（如玻璃片或试管），在37±℃保温，分别加入适量溶解物，然后。按照一定的时间间隔（以能够读出各个结果为宜），依次向每一器皿中加入与溶解物相同量的待测溶液，并立即轻轻摇匀，不要震动，要避免蒸发水分，培养反应物至于一定的、已知适合条件的环境，时间（一般为20~60分钟），然后读取结果。如果混合物形成凝胶，并且器皿轻轻翻动时不破粹，则表明其结果为阳性；相反，如果混合物不形成凝胶，则表明其结果为阴性。

溶解物的敏感度：至少准备标准细菌内毒素BRP的二倍稀释的四个重复系列浓度分别是2λ，λ，1∕2λ，1/4λ，此处的λ是所选用的固有溶解度，要求至少每一个的最后稀释液必须给出一阴性结果，依照步骤栏中所述，检测稀释液和由LAL水组成的阴性对照溶液，然后计算出每一系列中给出阴性结果的稀释液中所含细菌内毒素的最低浓度的对数值的平均值。这个平均值的反对数是溶解物敏感度的估计值。如果这个数值与固有敏感度相差不超过1/2倍稀释因子，则此固有敏感度便可以确定，并且有比溶解物进行的所有实验都采用这个值。

干扰因素：溶液的pH必须在特定的溶解物的限定范围内，产品的范围通常在pH6.0~8.0，如有必要，用0.1mLAL盐酸，0.1mLAL氢氧化钠或者合适的缓冲溶液将待测液调至pH6.0~8.0。

操作如“溶解物的敏感度”中所述，但准备标准内毒素ＢＲＰ的稀释液是采用待测制品中未经处理的样品，而这些样品中的内毒素是一检测不出来的。在最大的有效稀释度（ＭＶＤ）使用这些样品，比稀释度用下式计算：最大有效稀释度（ＭＶＤ）＝内毒素限定浓度/溶解物的敏感度

着两个值都是以每ml所含细菌内毒素的国际单位来表示的。

当细菌内毒素浓度是以每mg产品或每国际单位产品中所含内毒素国际单位数来表示的，此时将内毒素限定值乘以所检溶中的浓度（以mg/ml或所测产品的国际单位数/ml来表示）得到以每ml所测定溶液所含内毒素的国际单位数

表示内毒素限定浓度。上述相关方法，适用于组成与标签一致的产品浓度。

出了欧洲药典之外的其它专著中，给定物质或待测样品的界限通常表达为细菌内毒素的限定浓度IU/ml（以给定物质或待测品的指定溶液），在这种情况下，

以上的计算就没有必要。

在含有待测制品情况下测得敏感度值，如果与在不含有待测制品的情况下测得的敏感度值相差不大于1/2倍稀释因子，那么就可以认定待测品不含有不干扰实验条件的因素，可以不进行进一步处理而检测；反之，待测品就有抑制剂或激活剂的作用。添加能够置换出被吸收细菌内毒素的物质，选用一个较敏感的溶解物可使得待测制品的最大有效稀释倍数增大，以利于排除干扰。

如果待测制品的稀释低于最大有效稀释度而不能通过实验，则用最大有效稀释度重复测试。

当干扰物能通过截流相对分子量为10000到20000的膜过滤器中，就可以选用超滤的方法进行处理，可以使用三乙酸纤维素不对称膜过滤器，但使用前必须进行检查，因为它可能含有导至假的阳性反应实验的成分，截流在膜上的物质中含有细菌内毒素，用LAL水或适当的缓冲洗液使细菌内毒素重新溶于LAL水或者缓冲溶液中，对每一个待测样品的起始检测体积和处理后内毒素溶液的体积需要定量。

为了确定所选的处理方法能有效消除干扰，同时又不损失内毒素，可以将标

准内毒素BRP加入待测样品，并以同样的方法处理，重复干扰因素实验。

方法A：凝胶（限度法）

待检测样品中的内毒素；

用待检测样品（如有必要，可对其进行减少干扰因素的处理）的最大的有效稀释，依步骤栏中所述，进行两次平行样对照，同时检测一个由LAL水组成的阴性对照和两个阳性对照，对这两个阳性对照都含二倍溶解物固有敏感物浓度的标准内毒素BRP，其中一个还含有实验所用浓度的待检样品（加入标准内毒素后，如有必要，可以对其进行处理以减少干扰）。如果阴性对照和两个阳性对照，能全部给出适当的结果，则此次实验有效。