激光共聚焦显微镜原理及应用PPT精品课程课件讲义
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• XY扫描：获取更清晰的单层面、多通道的细节结构，应用于多种荧光定 位既共定位研究等。
• XYZ 扫描：获取图像三维信息，应用于标本空间实际位置信息研究。还
可以进行XZ/YZ的扫描。 • XYt扫描：获取图像的时间信息，研究活体标本随时间的变化，或在不同 时间采集不同的处理方法观察标本的荧光变化。如FRAP（荧光漂白后恢 复）、FRET（荧光能量共振转移）、FLIP （光漂白荧光损失）、光转化、 解笼锁、光活化、膜流动性、游离钙测定、pH值测定等。 • Xt/Yt/自由曲线/点扫描：扫描线/点上荧光信号随时间变化情况，由于线
PMT
检测器共焦针孔
激发滤光片
激光激 发光源
激发光线 光源共焦针孔 标本焦平面 标本
• 扫描单元在共聚焦系统中扮演着心脏的角色，担负着编排激发光线扫描 并同时获取标本发射光子的任务，并组合成最相遇图像。扫描单元一般 包括：外部激光输入口、XY扫描振镜、共聚焦针孔和PMT检测器。 • 场式照明与点扫描的比较
• 可以对厚荧光标本（可以达到50μm或以上）进行精细的光学切片，
切片的厚度约为0.5到1.5 μm。 • 采集足够的光学切片，就能通过软件对其进行三维重建。
• 可以同时获取和显示多标记荧光。而且共聚焦显微镜可以通过扫
描单元内的滤光片转轮，采用不同程度的带通滤光片，尽量减少 多色荧光之间的波段叠加，（新型的共聚焦显微镜采用光栅加狭 缝的方法可以随意调节发射荧光的波段和带宽，因而可以更好的 避免波段叠加），同时在激发过程中可以采取顺序扫描方式，这 样又避免了激发光对不同荧光染料的交叉激发。 • 还可以在不改变物镜的情况下对标本进行放大扫描。
谢谢聆听
THANK YOU FOR YOUR ATTENTION
黄色荧光素，沿样品在光轴上383μm的范围内，通过100μm焦平面厚度连续 截面扫描，得出一幅层叠的拟颜色示意图。
鼠海马神经元
绿色：海马神经元表达一种GFP标记的后突触密度蛋白 红色：这种蛋白由Radanmin-phalloidin固定染色后显示出胞质肌动
蛋白丝的位置。
共聚焦显微镜的扫描方式及应用
盖玻片 标本 载玻片 激发光束
场式照明（范围大）Байду номын сангаас
点扫描（范围小）
场式显微镜的照明范围和照明深度都很大，而共聚焦显微镜的照明则
集中到焦平面的一个精确的焦点上。 • 标本的共聚焦图像是一种重建的图像，是从PMT采集的荧光光子信号到 电子装置之间的点到点的成像系统，而不是从显微镜目镜直接观察到的 实际图像。
Confocal fluorescence images of a hacat cell (1 mm depth spacing)
20 um
excitation at wavelength 488 nm, the sample is labelled with EGFP
• 凤尾蝶的视觉中间神经元 ——给从凤尾蝶获得的视觉中间神经元注射Lucifer
• 传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受 到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光共聚焦显微镜利用激光扫 描束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描，标 本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增 管（PMT)，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。
共聚焦显微镜的优势
PPT内容可自行编辑
激光共聚焦显微镜原理及 应用
主讲：XX XX
凡大医治病，必当安神
定志，无欲无求，先发大慈恻 隐之心，誓愿普救含灵之苦。
- - 孙思邈
PPT内容可自行编辑
开始上课！
激光共聚焦显微镜的基本原理
• 激光系统光源发射的相干光相继通过位 于共扼平面 (confocal) 针孔光阑，该针孔 与标本上的扫描点及位于 PMT 检测器前 的第二个共焦针孔共扼。激光被分光镜 反射后在标本上的特定焦平面内扫描， 离焦光线 从该平面上点发射的激发荧光返回并穿 过分光镜后在检测小孔光阑处被会聚为 发射荧光吸 共聚焦点。 收滤光片 • 绝大部分物镜焦平面上面或下面点发射 聚焦光线 的荧光不能会聚到小孔，所以离焦荧光 只有一小部分能够通过小孔，大多数的 分光镜 离焦光线不能被 PMT 检测，不会影响最 终图像质量。分光镜、吸收滤光镜和激 发滤光镜在此系统中执行着与传统场式 物镜 反射荧光显微镜中同样的功能。在共聚 焦显微镜中改变物镜焦平面就是将激光 激发和荧光点转移到新的平面。新的平 面同样与光源和检测器的小孔光阑共扼。
扫的信号采样率为毫秒级，远远大于XY图像的获取速度，所以线扫经常
用于记录神经信号。
• XY-λ扫描：扫描XY平面图像在整个波段内的荧光强度变化。 通过该方法可以查看标本荧光光谱，可以确定最佳荧光
谱段，并且通过该方法可以拆分发射峰值极为接近的染
料或从较强背景荧光中提取染料荧光。 • 除上述扫描方式外，还有将多种扫描方式结合在一起的 扫描如：XYZt / XYZt λ等。还可以进行放大、局部和旋转 等模式的扫描，另外通过程序性扫描还可以将各种方式 集合到一起，在不同时间段进行各种模式的自动扫描。
• XYZ 扫描：获取图像三维信息，应用于标本空间实际位置信息研究。还
可以进行XZ/YZ的扫描。 • XYt扫描：获取图像的时间信息，研究活体标本随时间的变化，或在不同 时间采集不同的处理方法观察标本的荧光变化。如FRAP（荧光漂白后恢 复）、FRET（荧光能量共振转移）、FLIP （光漂白荧光损失）、光转化、 解笼锁、光活化、膜流动性、游离钙测定、pH值测定等。 • Xt/Yt/自由曲线/点扫描：扫描线/点上荧光信号随时间变化情况，由于线
PMT
检测器共焦针孔
激发滤光片
激光激 发光源
激发光线 光源共焦针孔 标本焦平面 标本
• 扫描单元在共聚焦系统中扮演着心脏的角色，担负着编排激发光线扫描 并同时获取标本发射光子的任务，并组合成最相遇图像。扫描单元一般 包括：外部激光输入口、XY扫描振镜、共聚焦针孔和PMT检测器。 • 场式照明与点扫描的比较
• 可以对厚荧光标本（可以达到50μm或以上）进行精细的光学切片，
切片的厚度约为0.5到1.5 μm。 • 采集足够的光学切片，就能通过软件对其进行三维重建。
• 可以同时获取和显示多标记荧光。而且共聚焦显微镜可以通过扫
描单元内的滤光片转轮，采用不同程度的带通滤光片，尽量减少 多色荧光之间的波段叠加，（新型的共聚焦显微镜采用光栅加狭 缝的方法可以随意调节发射荧光的波段和带宽，因而可以更好的 避免波段叠加），同时在激发过程中可以采取顺序扫描方式，这 样又避免了激发光对不同荧光染料的交叉激发。 • 还可以在不改变物镜的情况下对标本进行放大扫描。
谢谢聆听
THANK YOU FOR YOUR ATTENTION
黄色荧光素，沿样品在光轴上383μm的范围内，通过100μm焦平面厚度连续 截面扫描，得出一幅层叠的拟颜色示意图。
鼠海马神经元
绿色：海马神经元表达一种GFP标记的后突触密度蛋白 红色：这种蛋白由Radanmin-phalloidin固定染色后显示出胞质肌动
蛋白丝的位置。
共聚焦显微镜的扫描方式及应用
盖玻片 标本 载玻片 激发光束
场式照明（范围大）Байду номын сангаас
点扫描（范围小）
场式显微镜的照明范围和照明深度都很大，而共聚焦显微镜的照明则
集中到焦平面的一个精确的焦点上。 • 标本的共聚焦图像是一种重建的图像，是从PMT采集的荧光光子信号到 电子装置之间的点到点的成像系统，而不是从显微镜目镜直接观察到的 实际图像。
Confocal fluorescence images of a hacat cell (1 mm depth spacing)
20 um
excitation at wavelength 488 nm, the sample is labelled with EGFP
• 凤尾蝶的视觉中间神经元 ——给从凤尾蝶获得的视觉中间神经元注射Lucifer
• 传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受 到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光共聚焦显微镜利用激光扫 描束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描，标 本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增 管（PMT)，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。
共聚焦显微镜的优势
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激光共聚焦显微镜原理及 应用
主讲：XX XX
凡大医治病，必当安神
定志，无欲无求，先发大慈恻 隐之心，誓愿普救含灵之苦。
- - 孙思邈
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激光共聚焦显微镜的基本原理
• 激光系统光源发射的相干光相继通过位 于共扼平面 (confocal) 针孔光阑，该针孔 与标本上的扫描点及位于 PMT 检测器前 的第二个共焦针孔共扼。激光被分光镜 反射后在标本上的特定焦平面内扫描， 离焦光线 从该平面上点发射的激发荧光返回并穿 过分光镜后在检测小孔光阑处被会聚为 发射荧光吸 共聚焦点。 收滤光片 • 绝大部分物镜焦平面上面或下面点发射 聚焦光线 的荧光不能会聚到小孔，所以离焦荧光 只有一小部分能够通过小孔，大多数的 分光镜 离焦光线不能被 PMT 检测，不会影响最 终图像质量。分光镜、吸收滤光镜和激 发滤光镜在此系统中执行着与传统场式 物镜 反射荧光显微镜中同样的功能。在共聚 焦显微镜中改变物镜焦平面就是将激光 激发和荧光点转移到新的平面。新的平 面同样与光源和检测器的小孔光阑共扼。
扫的信号采样率为毫秒级，远远大于XY图像的获取速度，所以线扫经常
用于记录神经信号。
• XY-λ扫描：扫描XY平面图像在整个波段内的荧光强度变化。 通过该方法可以查看标本荧光光谱，可以确定最佳荧光
谱段，并且通过该方法可以拆分发射峰值极为接近的染
料或从较强背景荧光中提取染料荧光。 • 除上述扫描方式外，还有将多种扫描方式结合在一起的 扫描如：XYZt / XYZt λ等。还可以进行放大、局部和旋转 等模式的扫描，另外通过程序性扫描还可以将各种方式 集合到一起，在不同时间段进行各种模式的自动扫描。