高产谷氨酸产生菌的工艺研究

高产谷氨酸产生菌的工艺研究

Study on technology of high yielding glutamic acid producing strains

13生工杨雅娴

前言工业发酵研究和开发的主要目标之一是建立一种能实现高产、低成本的可行过程，生产条件优化是改进现有菌种产量的重要方法。本文对发酵法生产谷氨酸的试验流程进行优化，探讨发酵生产过程中的关键影响因素，发现谷氨酸发酵生产中，溶解氧水平是发酵生产的限制瓶颈，也是得到高产谷氨酸的关键因素之一。因为低溶氧更有利于产乳酸，乳酸产量增加将直接导致谷氨酸产量减少。试验以糖质原料为出发，结合谷氨酸产量跟踪，确定了菌株由“生长型”转化为“生产型”的时间，从而确定了“分瓶”培养的方法。发酵前期注重菌体的生长培养，发酵后期减少液体量以增大溶解氧来进一步提高谷氨酸产量。通过这种培养，得到一套较为完整的谷氨酸摇瓶发酵的方案。同时，对发酵过程中培养基及培养条件进行优化，得到较好的谷氨酸产量。

Industrial fermentation research and development one of the main objectives is to establish which can realize high yield, low cost feasible process, optimization of production conditions is important for improved strains of existing production methods. This article to optimize the testing process of the glutamic acid production by fermentation, explores the key influencing factors of fermentation found in glutamate fermentation, the level of dissolved oxygen is the limit of production bottlenecks, is also one of the key factors of high yielding glutamic acid. Due to low dissolved oxygen is more conducive to production, will lead directly to an increase in production of glutamic acid production of lactic acid. Experiments with sugar raw material based on the combination of glutamic acid production tracking, strains were determined by "growing" into "production" time, so as to determine the "bottle" method of training. Fermentation early focus on bacterial growth, late fermentation to further reduce the amount of liquid to increase dissolved oxygen increasing glutamic acid production. Through this training, get a more complete fermentation of glutamic acid solution. Same time, to optimize fermentation culture medium and culture conditions, get a better production of glutamic acid.

一、谷氨酸棒杆菌的诱变选育

1.1 试验方法

1.1.1菌种纯化谷氨酸棒杆菌W3 平板（完全培养基）划线分离。32 ℃，培养24～30 h，挑取单菌落，继续纯化培养，如此反复三次，保证菌落纯后保藏。

1.1.2菌种保藏用斜面保藏培养基，4 ℃保藏。

2.

3.3 斜面活化W3 菌株(分离纯化后)接入斜面培养基，32 ℃培养24 h。

1.1.3种子液摇床培养条件32 ℃，200 r/min。

2.

3.5 种子培养取活化菌种两环接入装有30 m L/250 m L 种子培养液的三角瓶中，摇床培养16 h。

1.1.4.1紫外诱变处理

（1）菌种活化

（2）菌体前培养：取活化菌种接入种子培养基，种子培养至对数期，然后以5 %的接种量转接至相同的种子培养基培养至对数期，下摇床，置于4~6 ℃低温静置 2 h，低温诱导菌体同步生长后，取出放至室温，以20 %的接种量转接至新鲜的种子培养基，培养2~3 h，使细胞处于同步生长状态备用。

（3）紫外诱变处理：取同步生长的种子液，以0.85 %的生理盐水稀释至10-7，取5 m L稀释液加到直径9 cm培养皿中，于磁力搅拌器上搅拌并放置于15 W紫外灯下30 cm 处，开启皿盖搅拌照射不同时间。此过程在红光下操作，以免光复活作用影响诱变效果。

诱变结束后用移液枪吸取0.2 m L涂布于筛选培养基。

1.1.4.2亚硝酸钠诱变处理[50] 取0.2 mol/L的亚硝酸钠溶液1 ml加入大试管中，加入1 ml同步生长状态下的种子液，立即加入1 m Lp H 6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，充分混合后，置27 ℃水浴，诱变不同时间，以选择致死率达80 %的作用时间。加0.07 mol/L p H 8.6 的Na2HPO4溶液2 ml，终止反应。

2.

3.8 筛选方法2.3.8.1 营养缺陷型的平板筛选取诱变菌液0.2 m L涂布到基本培养基与添加了适量Glu的基本培养基中，32 ℃培养2 d，对照平板，选择基本培养基中不生长而添加Glu培养基中生长的菌落分离纯化，保藏。

1.2谷氨酸营养缺陷型回复突变株及天冬氨酸渗漏性突变株平板筛选

（1）谷氨酸营养缺陷型回复突变株平板筛选取适当的诱变菌液0.2 m L涂布到基本培养基中，32 ℃培养2 d，选取生长的菌落，分离纯化，保藏。

（2）天冬氨酸渗漏性突变株的平板筛选取适当的诱变菌液0.2 m L涂布于基本培养基与添加少量Asp的基本培养基中，32 ℃培养2 d，选取在基本培养基中生长的菌落较小，而在添加了天冬氨酸的基本培养基中生长较大的菌落，分离纯化，保藏。2.3.8.3 谷氨酰胺抗性突变株的平板筛选适当的诱变菌液0.2 m L涂布到含不同量的Gln的基本培养基中，选择菌体不能生长时的谷氨酰胺添加量，加入到基本培养基中，制成筛选平板，将诱变菌液涂布筛选平板后32 ℃培养2 d，选取生长的菌落，分离纯化，保藏。

1.2.1初筛取目的菌液的种子液（对数期），稀释至10-7，涂布完全培养基，32 ℃培养3d，然后牙签法点种于两个相同的完全培养基平板，用打孔器在平行平板的其中一个的相同的菌落上方打孔，取出琼脂柱，置于96孔板之中，滴加0.1 %甲基红溶液1滴，颜色由红至黄，表明菌株产酸由高到低。选取产酸相对较高的菌株，用另一平行平板保藏，以备复筛。

1.2.2复筛将初筛得到的菌株以24孔板进行种子培养以及发酵培养后，滴加中性红检测产酸水平(平行三个实验)，选取相对较红的菌液对应的菌株保藏，以备复筛II。

1.2.3复筛Ⅱ将复筛I得到的菌株摇瓶发酵，筛选高产菌株（平行三组实验）。

1.2.4 分析方法2.3.9.1 p H 的测定取少量发酵液于精密p H试纸确定p H。

1.2.5菌体生长曲线测定取活化菌种两环接入装有30 m L/250 m L三角瓶中（加15粒玻璃珠，下同。），摇床培养16 h后，以2 %接种量转接到另一相同的完全液体培养基中继续培养，每隔2 h取样一次，用蒸馏水稀释100倍后，用752分光光度计于波长620 nm 条件下测量吸光度(A620)。以时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制菌体生长曲线，平行三次试验。2.3.9.3 谷氨酸含量及残糖含量的测定用SBA-40C多功能谷氨酸-葡萄糖分析仪测定样品的谷氨酸以及残糖。样品经稀释后由定量进样针吸取25 μL，并快速注入反应池，读取相应的数值，记录。

二、摇瓶分批发酵产谷氨酸的发酵条件优化

2.1材料与方法

2.1.1实验菌株诱变得谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）W3-4-12（Glnr，Asp 渗漏性）。

2.1.2实验仪器与试剂