实验准备与无菌操作规范

【实验目的】

1.掌握细胞培养的基本概念

2.了解细胞培养的基本条件

3. 掌握清洗和消毒的基本方法

4. 学习细胞培养使用液的配制及准备方法

【实验原理】

1.体外培养（in vitro culture) 的基本概念

将活体结构成分（甚至个体）从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。按照体外培养的结构成分，可将体外培养人为地分为：组织培养（tissue culture）、器官培养（organ culture）、细胞培养（cell culture)

（1）器官培养（Organ Culture）培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。

（2）组织培养(Tissue Culture)是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在模拟体内生理环境下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。

（3）细胞培养(Cell Culture)是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。

2. 组织细胞培养的优点

能够长时间观察细胞的生命活动

容易控制实验条件，有利于生物学研究

容易直接采集细胞及亚细胞结构的图象

便于各种细胞染色处理和标记

培养细胞的单一性，有利于排除干扰因素

3. 体外培养技术的应用：

基础研究：细胞生物学乃至整个生命科学研究中最基本的实验技术之一。被培养的组织或细胞是良好的实验材料。细胞培养广泛应用于现代医学和生物科学研究之中

生产实践：疫苗生产、药物研制与肿瘤防治等医学实践提供了全新的手段

4. 组织细胞培养的基本条件

（1）无污染的环境条件

（2）适当的温度:由酶和蛋白质所需要的最适温度决定

35－37℃(人和哺乳动物细胞)

（3）气体环境与pH环境： (人和哺乳动物细胞)

（4）营养条件

（5）其它条件：等渗条件、附着底物

5.无污染的环境条件

凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染。（1）污染的种类

A．物理污染:

温度: 解决对策：孵箱放在温度较恒定的房间中, 培养液从冰箱取出后在室温放置. 放射线与辐射:解决对策：试剂周围不能放同位素,尽量不放在带有玻璃门的冰箱中.

振动:解决对策：孵箱周围不能放引起振动的设备.

其他：尘土、玻璃残渣等.解决对策：严格清洗.

B. 化学污染

水: 解决对策：用双蒸和三蒸水配液和清洗容器（现在用纯水仪millipore超纯水）

容器: 生产过程中有毒物质残留（铅、砷）;消毒剂和清洗剂的

残留;铝箔和包裹纸残留

解决对策：培养用各种器皿的严格清洗（泡酸）

培养箱:co2混有有毒气体; 消毒剂和清洗剂的残留

解决对策：购置高质量的CO2

C.生物污染

细菌、霉菌和酵母:易被发现,易造成隐性污染

病毒: 最难发现和清除,严格的宿主性,自限性

支原体：污染严重,难发现 ,难清除

原虫、昆虫：

其它细胞系：

解决对策：实验用品严格灭菌，无菌操作同一时间只传同

一种细胞,每种细胞要有单独的液体

建立细胞库，每三个月更换一次细胞

6.清洗与灭菌

除去各种玻璃或塑料器皿上对细胞生长有影响的各种杂质以及消除附着在其上的各种微生物及化学物质，改善玻璃表面性质，有利于细胞的粘着和生长。

清洗和消毒是否彻底直接关系到体外培养的成败。

（1）清洗

玻璃器皿：培养瓶、吸管、滴管、试管等

浸泡在清水中，刷洗→烘干→浸酸→冲洗（15遍自来水后3遍蒸馏水→倒置烤干→包装→干热消毒

胶塞（旧）：用加入适量洗涤灵的水溶液煮沸30分钟，自来水冲洗→蒸馏水漂洗3次→晾干→包装→湿热灭菌→烘干备用

胶塞（新）：水中浸泡→ 2%NaOH煮10-20min →自来水冲洗10次→ 1%HCl浸泡30min →自来水冲10次，蒸馏水洗3次→晾干→包装→湿热灭菌→烘干备用。

金属器械：自来水洗→ 75%酒精擦→湿热灭菌、包装→烘干备用或者自来水冲10次，蒸馏水3次→晾干→包装→湿热灭菌→烘干备用

（2）细胞及组织培养用品的包装

1．局部包装：滤器，培养瓶口

2. 全包装：胶塞、瓶盖、金属器械、注射器、小的瓶皿等

（3）细胞及组织培养用品的消毒与灭菌

射线消毒: 用钴60等发出的射线消毒灭菌。适宜用于量大或不适做高压、干热或过滤处理的培养用品，如塑料制品等。

紫外线消毒: DNA损伤，臭氧，双氧水。适用于空气、主要用于培养室空气、操作台、塑料、培养皿和培养板等表面消毒.

【注意事项】：空气消毒时灯管应距地面 m以内；台面的消毒应在80 cm以内；培养器皿的消毒在30 cm以内。不要让紫外线照射人的皮肤。

干热灭菌: 高温变性， 160℃保温90－120 min适用于玻璃器皿

【注意事项】温度降至100℃之下才能开烤箱门。

湿热灭菌:高温变性。 121度，15磅30分或115度，10磅20分。适用于胶塞、瓶盖、玻璃器皿、滤器、枪头塑料物品、PBS、LB等不易产生沉淀的液体

过滤除菌：适用于培养基、胰酶、TdR、秋水仙素、谷氨酰胺、抗生素等对热不稳定的试剂及药物

化学消毒: 来苏%)、新洁尔灭（%）、乙醇（70- 75%）、乳酸、过氧乙酸%)

火焰消毒：仅限于无菌操作过程，在火焰近处并经过烧灼进行。用于培养瓶、滴管、试管、吸管等。

注意：等用品冷却后放可接触活的组织和细胞。

抗生素的抑菌作用：青霉素、链霉素各100单位/ mL 培养基

7. 平衡盐D–Hanks缓冲液的配制

平衡盐溶液（balanced salt solution,BSS）主要是由无机盐、葡萄糖组成。它的作用是维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定及提供简单的营养。主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。

D-Hank‘s与Hank’s的一个主要区别是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank‘s常用于配制胰酶溶液。

D–Hanks的配制

配方（1000 mL）：KCl ；KH2PO4 g； NaCL 8 g； g；NaHCO3 g；酚红（2%，1 mL）————可不加

【实验仪器、材料、试剂及用品】

1.细胞培养用品：玻璃器皿；滤器；塑料及橡胶制品; 滤膜；棉花；酒精灯等

2. 药品及试剂： KCl ; KH2PO4 ; NaCl ; Na2HPO4;NaHCO3酒精;新洁尔灭

【实验步骤】

1.无菌室及互动显微镜室、仪器的使用规则

2.针头滤器的安装与灭菌：安装滤膜（μm光滑面朝上），高压灭菌。

–Hanks缓冲液的配制及灭菌处理。

4.练习清洗培养瓶。

5.练习包瓶子、塞子、插枪头、切盖玻片，移液管塞棉花等。

%酒精配置、酒精棉球制作以及酒精灯内酒精添加。