微生物和基因工程

微生物和基因工程

基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。

基因工程微生物的构建包括以下基本步骤：

用限制性内切酶对质粒的特定位点进行切割，形成粘性末端；

用同样的限制性内切酶对含有目标基因的外源DNA分子进行切割，两端形成与质粒上的粘性末端相互补的单链；

将切割好的质粒和基因片段混合并通过DNA连接酶键合在一起完成基因重组并重新成为环状分子；

将重组质粒转化到微生物细胞内。

基因工程的基本过程：

1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。

2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。

3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。

4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。

限制性内切酶：

识别并在特定位点切开DNA

DNA连接酶

通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子

分子克隆的载体----具备自主复制能力的DNA分子（vector），如病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。

基因载体的结构和功能：

生物学来源：

细菌质粒噬菌体病毒其它

多个不同来源独立的元件，包括高等生物的一些基因组元件结合使用，从而产生了一系列新的基因载体

质粒载体的结构和功能

大部分为双链闭环超螺旋DNA分子，也有线性质粒，质粒的分子规模从2kb到1mb。

质粒主要见于细菌，也见于古细菌和酵母菌。

质粒编码的性状一般包括抗性特点，如抗生素抵抗，不利环境抵抗（重金属抗性），产毒特性和抗毒特性等。

从质粒本身的特性来看，质粒具备复制特性，分离特性，判别特性和进化特性。

基本特性

复制子遗传标记多克隆位点其它

许多元件往往只在一定的生物宿主环境下才表现出对应的生物学特点

遗传筛选标记

抗生素抗性标记

抗突变标记

人工插入失活和α互补标记

抗生素标记：

氨苄青霉素抗性（ampr）基因编码β-内酰胺环水解酶，分泌到细菌膜周隙水解氨苄青霉素。卡那霉素抗性基因（kanr）其决定质粒对氨基糖苷类抗生素的抵抗。在质粒在大肠杆菌使用，

也用于真核生物体系，作为G418的筛选基因。其基本原理是基因产物氨基糖苷转移酶对抗生素的磷酸化灭活。

四环素抗性基因（tetr）编码一个300氨基酸的膜蛋白可以妨碍四环素被细胞吸收

氯霉素抗性基因（cat or cmr）编码氯霉素乙酰转移酶可以灭活氯霉素结合核糖体的能力。潮霉素抗性基因（hygromycin resistance, hph）和嘌呤霉素抗性基因（puromycin resistance, purr）也时常用的抗性标记。hph编码潮霉素磷酸转移酶，而后者可以消除嘌呤霉素对核糖体A位的干预。

质粒抗突变作用：

质粒抗突变作用也是基本的筛选标记之一，如抗终止突变。SupF编码的tRNA可以用UAG 编码酪氨酸。但是现在由于其他筛选标记的方便性这些标记使用有限。营养缺陷性突变在细菌使用并不广泛，但是在酵母体系应用的比较多，如Leu2, His3, Trp1等。

插入失活和α互补：

插入失活可以用于任何功能基因，事实上目前应用较多的有tetr基因的插入失活，基本原理是在基因中设计多克隆位点，外源基因插入将导致标记基因产物功能丢失。

α互补的基本原理在于β半乳糖苷酶两个缺陷型的互补作用。在宿主菌预设F质粒携带的LacZdeltaM15突变基因，而在研究载体中附加编码N端140个氨基酸的LacZ’基因，中间设计多克隆位点，如果外源基因插入则使α互补作用消失。通过使用x-gal就可以检测到互补作用的情况。

噬菌体载体的结构和功能：噬菌体主要有两个基本来源。λ噬菌体和M13噬菌体。

载体在宿主中的转移：结合转化转导转染

细菌转化：

所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。处于能够接受外源DNA状态的细胞称为感受态细胞

步骤：

1.将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。

2.与转化混合物中的外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。

3.立即将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收。

4.在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、细胞活性恢复

5. 涂布于选择性培养基中分离转化子。