Agilent+1260+HPLC+工作原理及色谱柱的使用和保养20140222

仪器LED 状态显示
Blink
电源开关显示
开机/关机操作
清洗阀Purge Valve
• 逆时针旋转打开清洗阀，清洗 阀打开时，液体从废液管中流 出，为清洗状态。 更换溶剂后，打开清洗阀，设 置流量5ml/min，冲洗5-10 min. 顺时针旋紧清洗阀为关闭状态, 此时流动相由毛细管流向进样 器.
HPLC各模块的工作ຫໍສະໝຸດ Baidu理及维护
样品准备
关于进样器
过滤样品，确保样品中不含固体颗粒 用流动相或比流动相弱的溶剂溶解样品
进样量尽量小
样品完全溶解在流动相中
样品没有完全溶解
HPLC各模块的工作原理及维护
关于进样器
准备位置
调用样品瓶 吸样品
进样和运行位置
标准进样过程 ...
HPLC各模块的工作原理及维护
Agilent 1260 HPLC 工作原 理及色谱柱的使用和保养
2013.5.31
Agilent 1260 HPLC 工作原理及简单操作
• 培训目的：
1.了解HPLC各模块的原理； 2. 掌握HPLC各模块日常维护的要点； 3. 掌握开机，关机。
Agilent 1260 HPLC 工作原理及简单操作 • 内容： 一、 HPLC各模块的原理及维护；
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色谱柱的使用和保养
良好的色谱实验习惯
• 拿到一根新色谱柱时，先测柱效 • 保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录 条件 • 给新色谱柱建立一个档案 • 定期检测柱效
色谱柱的使用和保养
色谱柱的申购
色谱柱的使用和保养
色谱柱的领用及归还
• 分析室所有色谱柱按照类型进行编号登记造册，建立色谱 柱档案，注明采购时间及使用项目名称。 • 领用新的色谱柱时由使用人按照说明书进行冲洗，按要求 测柱效，并做好记录。 • 分析室所有色谱柱统一放置，取出及归还色谱柱时要做好 登记。 • 试验结束后，使用人要正确冲洗色谱柱，同时记录好与试 验、色谱柱相关的信息；不影响自己及其他人的再次使用 • 如发现色谱柱压力高、峰型差等异常问题，使用人要及时 冲洗并按照说明书检测柱效，遇柱效差或分离差的色谱柱 附上柱效检测报告，报室主任，同意后报废，统一放置。
HPLC各模块的工作原理及维护
检测器—DAD
• DAD (Diode Array Detector)二极 管阵列检测器，是以光电二极管
• 阵列作为检测元件的UV-VIS检测器. DAD的光源—氘灯有一定的半衰期， 一般为1000小时左右，所以在没有样 品分析任务时要关闭氘灯，以延长氘 灯的使用寿命,但是也不要频繁的开关, 这样也会影响寿命。同时，打开灯需 要预热10min 左右，灯使用时间越长， 预热的时间也要越长。 流通池污染后，会造成灵敏度下降、 噪声加大，应避免脏的样品进入流通 池。定期使用异丙醇冲洗系统对保持 流通池性能有一定好处。
自动进样器
•样品要干净、经过过滤。 洗针：把样品残留降低到最 小限度，可降低进样的记忆 效应，洗针瓶最好不要加瓶 垫。 多次吸液 用于进样量大于100μ l
HPLC各模块的工作原理及维护
关于恒温柱箱
• 控制范围：最高80º C，低温低于 室温10º C。 • 预热块体积左面为3ul，右面为6ul， 除非有特殊要求，左右温度应保 持一致。 • 一定要关闭前面板。
•
HPLC各模块的工作原理及维护
检测器—DAD
HPLC各模块的工作原理及维护
检测器—FLD
•FLD(Fluorescence Detector) 荧 光检测器：是利用某些溶质在受 到紫外光激发后，能发射可见光 （荧光）的性质来检测的。 •FLD是一款具有高度灵敏度和高 度选择性的检测器。其激发光源 是氙灯，此灯不需要预热。 •其流通池和DAD的一样，也要定 期用异丙醇冲洗，以保证性能。
色谱柱的使用和保养
•内容： 一、 正确使用色谱柱；
二、色谱柱的日常清洗和存放。
色谱柱的使用和保养
色谱柱的选择
• 非极性或极性较小的样品可用一般的C18柱 • 酸碱性的化合物建议选用填料经封尾钝化 过的C18柱，PH范围2-9（12） • 糖类，氨基酸，有机酸，多环芳烃，GPC有 专用柱 • 超快速柱子-填料粒度<2µm
– 除去微粒及杂质 – 了解样品在流动相中的溶解度
• 如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解 度，防止其在流动相中析出
– 了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用
色谱柱的使用和保养
为什么溶剂和样品要过滤?
• 溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除 由于污染对分析结果的影响。 • 色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小 颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。 • 仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也 会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。 样品过滤头的类型： • 30mm 内径：适用于大进样量的过滤，由0.22μm 和0.45μm 两种规格, 材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50μl。 • 13mm 内径：适用于范围广的过滤，由0.22μm 和0.45μm 两种规格,材 料为纤维素。 • 3mm 内径：适用于小进样量的过滤，由0.22μm 和0.45μm 两种规格 。处理样品体积为7μl。
HPLC各模块的工作原理及维护
关于溶剂
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所有溶剂应为HPLC级，水应为二次超纯水； 所有溶剂应经过过滤。过滤水应使用水相滤膜，过滤 有机相应使用有机相滤膜，不能混用。每一次滤膜只 能用一次，不能重复使用； 如果没有在线脱气机，所有溶剂应经过超声脱气； 水易滋生藻类，避免直接照射，过滤水最好使用不要 超过两天； 如果条件允许可向溶剂中加入0.001-0.0001M的叠氮 化钠； 注意溶剂的相容性，避免使用不相容的溶剂； 避免使用强酸、强碱或有机氯等腐蚀性溶剂； 在溶剂瓶中的溶剂过滤头可能会堵塞，必要时小心拿 下用强酸（35%硝酸）浸泡时，用水冲洗，但不要使 用超声处理。
二、开机/关机操作；
一 、 HPLC各模块工作原理及维护
HPLC： 高效液相色谱仪（High Performances Liquid Chromatography）。 由储液器、泵、进样器、色谱柱、检 测器、记录仪等几个部分组成。 工作原理：工作时储液器中的流动相 被泵打入系统，样品溶液经样品进样器 进入流动相，被流动相载入色谱柱（固 定相）内，由于样品溶液中的各组分在 两相中具有不同的分配系数，在两相中 做相对运动时，经过反复多次的吸附-解 吸的分配过程，各组分在移动速度上产 生较大的差别，被分离成单个组分依次 从柱内流出，通过检测器时，样品浓度 被转换成电信号传送到记录仪，数据以 图谱形式打印出来。
开机/关机操作
指示灯状态
每个部件接通电源后 LED灯显示绿色
6种LED仪器状态：
关机 power off 准备进样 power on 没准备好Not Ready 运行Run 故障Error 驻留Resident 黑Black 黑Black 黄Yellow 绿Green 红Red 黄闪烁Yellow blinking
毛细管出口,流向进样器
• •
顺时针关闭清洗阀
废液管,清洗阀打开 时溶剂由此流向废液 瓶.
逆时针打开清洗阀
开/关机操作
整台液相色谱仪的维护
每次用过仪器后必须做!
1. 在使用过含盐缓冲液后必须清水冲洗泵15分钟，此时 必须打开排放阀，不能使废液进入色谱柱。 2. 关上排放阀，用90%+10%的水、甲醇溶液冲洗整个系 统，时间为15～20分钟，流量1ml/min。本步骤主要是冲 洗干净系统内其他含盐的部位。 3. 用纯的强溶剂冲洗整个系统，时间为1小时，流量为 1ml/min。本步骤主要是保护色谱柱。 4. 如果未使用缓冲液，上面1、2两步骤可免去，直接用 纯的强溶剂冲洗整个系统，时间为1小时，流量为1ml/min。 5.如果较长时间不使用色谱仪，所有管道先用纯水冲洗，再用甲醇冲洗， 让所用管路都保存在甲醇中，防止长菌。
过滤白头
金密封垫
聚四氟乙烯密封垫
HPLC各模块的工作原理及维护
更换过滤白头
1，去掉毛细管，废液管
2，卸掉清洗阀
3，更换过滤白头
4，更换白头，装好清洗阀
HPLC各模块的工作原理及维护
泵的注意事项
1，溶剂的过滤、脱气； 2，避免使用腐蚀性溶剂； 3，在满足分析的前提下，尽可能使用 较低的流速—较低的系统压力。 4，更换过滤白头； 5，考虑溶剂的相容性； 6，尽可能使用新鲜的水； 7，使用0.01M以上浓度的缓冲溶液要 选配柱塞清洗组件，清洗液不能干 涸。 8，使用正相溶剂比如环己烷时，建议 使用聚乙烯密封垫，部件号为09051420，在0—200Bar下使用聚乙烯 密封垫比标准密封垫更耐磨损。 • 四元泵： 四元泵多通道比例阀MCGV使 用时注意，缓冲溶液要放在D通 道，以避免盐颗粒析出。建议A 通道：水；B、C通道：有机溶 剂；D通道：缓冲溶液。
色谱柱的使用和保养
键合相色谱柱
• 以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基 等基团联在基质上作为固定相。这种固定相要占所有柱填 料的60-70% • 优点∶ – 固定相稳定，不易流失 – 应用广泛，可使用多种溶剂 – 消除硅羟基的不良影响 • 缺点∶ – pH值不能小于2或大于8 – 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同
HPLC各模块的工作原理及维护
关于泵：（四元泵）
HPLC各模块的工作原理及维护
关于泵（泵头组件）
柱塞杆Piston
活塞外框架
泵头密封垫
主动输入阀AV
清洗阀Purge Valve
Seal Wash组件 泵腔
出口球阀BOV
HPLC各模块的工作原理及维护
更换过滤白头
清洗阀PurgeValve • 在清洗阀中的过滤白头需要更换，在清 洗状态下，设置流量为5ml/min，此时 系统压力如果超过10bar，则需更换过 滤白头。 • 更换步骤： 1，关闭泵电源； 2，用扳手去掉通往进样器上的毛细管，拔 掉废液管； 3，用专用扳手小心把清洗阀卸下来； 4，轻轻去掉聚四氟乙烯密封垫和金密封垫， 将过滤白头拿出； 5，更换新的过滤白头，装上聚四氟乙烯密 封垫和金密封垫； 6，装上清洗阀； 7，连接管路。
色谱柱的使用和保养
反相HPLC柱（C18）的性能
• 常规C18填料的稳定性 – 硅胶基质填料 – pH范围：2-8 – pH值大于7时 键合相粉碎或溶解 – pH值小于2时 键合相的化学键断裂 – 经常用缓冲液 固定相降解 • 填料新的键合技术 - PH范围 2-12 - 稳定性好，使用寿命长
硅 胶 的 溶 解 曲 线
HPLC各模块的工作原理及维护
检测器—RID示差检测器
二、 开机/关机操作
• 开机操作： 1，打开计算机。 2，自上而下打开LC各模块的电 源，等待仪器自检完毕，12min。 3，双击桌面上“Instrument 1 Online‖图标，进入化学工作 站,在工作站打开各工作模块。 4，打开Seal Wash清洗液开关， 清洗各管路(5~10min)。 5, 拧上清洗阀，将流量慢慢设 为所需流速，平衡30min即可 以进样样。 • 关机操作： 1，如果使用了缓冲溶液流动相 应先用水（5~10%甲醇）冲 洗系统30min。 2，用纯有机相冲洗系统30min。 3，在工作站上关闭各个模块。 4，退出工作站，关闭计算机。 5，自下而上关闭LC各个模块 的电源。
HPLC各模块的工作原理及维护
关于在线真空脱气机
• 在线真空脱气机的管路容量为 12ml，压力范围为110Torr190Torr。 • 为保证脱气机的良好使用性能， 在下述情况下需要用注射器抽洗 脱气机管路，每个通道使用不低 于30ml的异丙醇。 1，新的脱气机或新的管路； 2，更换了溶剂，尤其是缓冲盐与有 机相之间、两个不相容流动相之 间的互换时； 3，输液泵关闭了一段时间，或使用 挥发性溶剂混合物。
色谱柱的使用和保养
色谱柱的使用及操作
• 流动相的转换
– 特别是GPC柱
• 流速(压力)的变化幅度 • 温度的变化幅度 • 专用色谱柱∶样品及溶剂的要求
记 住 ∶ 拿 到 一 根 从 未 用 过 的 色 谱 柱 时 一 定 要 先 看 其 使 用 说 明 ！
色谱柱的使用和保养
色谱柱的保养（一）
• 样品方面