精子冷冻复苏效果的影响因素

精子冷冻复苏效果的影响因素

【摘要】不育症在世界范围内的发生率为l0％～15％，其中约有一半因素来源于男方。流行病学研究早已证实，近50年以来，男性精液的质量持续下降．男性精子几乎减少了一半并且每年还以2.1％的速度在减少。男性不育人数的增多甚至出现精子危机。为了应对精子质量的下滑，保存技术显得尤为重要。本文即对精子冷冻复苏保存的影响因素进行探讨与总结。【关键词】精子；冷冻复苏；精浆；精子危机；储存

环顾四周，男性不育人群日渐增加，精子库也成为越来越多不育家庭求助的借精之地。实际上，“精子危机”是否存在在学术界也有争论。2013年欧洲人类生殖与胚胎学会伦敦年会上关于男性的精子危机仍争论不一[1]。中华医学会男科分会候任主任委员姜辉说，他所在的北京大学第三医院接诊的不育患者中，无精症男性比例从2004年的6%上升到2008年的10%。同时，世界卫生组织颁布的“精子质量合格线”一直在下降，至2010年为1500万个，已是30年前的四分之一。为了应对精子质量的下降，人类精子的冷冻保存则逐渐成为人类精子库及生殖中心工作的重要组成部分。其用途主要体现在：供精者精液保存、男性生育力保存、男性不育症的治疗及最大限度降低传染性疾病的传播。因此，精子冷冻复苏的效果也越来越受到重视。

虽然我国人类精子库的数量较多，至2011年12月我国共批准建立了15家人类精子库。但需要的夫妇数量也很多，至今仍存在供不应求的情况，使得精子的储存越来越受到重视。影响精子冷冻复苏率的因素比较多，主要分为自身因素和非自身因素。本文通过查阅最近国内外文献，将影响精子冷冻复苏效果的因素分为实验室因素（冷冻保护剂、冷冻方法、复苏方法等）、精液自身因素（精浆因素、精子因素）及其他因素（季节、禁欲时间）等并作如下综述：

1. 实验室因素对精子冷冻复苏效果的影响

近年来，有大量文献研究如何提高人类精子的冷冻复苏率，影响人精子冻贮后效果的实验室因素主要有：冷冻保护剂、冷冻方法、精液与保护剂的比例、精液处理后冷冻、精液复苏方法、冻存时间等。

1.1 冷冻保护剂

研究表明，未添加冷冻保护剂的精子在冷冻贮存并复温后，仅有0.1%的精子具有一定程度的运动能力。在精子冷冻之前，为了减轻精子冷冻及复温过程中细胞的损伤，须加入一些具有保护作用的物质，这些物质统称冷冻保护剂。而精子细胞里的活性氧（ROS）具有很强的氧化活性，其浓度过高可以诱导细胞的脂类、蛋白及细胞内的DNA氧化损伤，从而引起一系列的病理变化。有些不育男性精液中缺乏与这些氧化物抗衡的物质，从而引起不育。有研究认为精浆中过多的ROS会导致精子的氧化损伤，以至于精子的功能受损以及精子核和精子DNA受损[2]。因此，ROS导致人精子的损伤，也可能降低精子对冷冻复温的抵抗能力[3]。

有许多研究认为在冷冻保护剂中添加一些抗氧化物质（如：维生素E、抗坏血酸葡糖苷、谷光甘肽、抗坏血酸和过氧化氢酶等）可以保护精子功能，明显提高精子的冷冻复苏率。在冷冻保护剂中添加维生素E可以提高冷冻后精子的活动力及精子DNA的完整性[4、5]；在冷冻保护剂中添加抗坏血酸等物质可以提高精子冷冻复苏率，LI等研究发现，在精子冷冻保护剂中添加抗坏血酸和过氧化氢酶可以抑制ROS的活性，从而可以提高精子冷冻复苏率[6]。另外，添加谷胱甘肽（GSH）对精子冷冻损伤也有一定的保护作用[7]。但也有研究认为不添加保护剂直接冻存和添加保护剂对精子DNA完整性的影响无显著差异[8]。

1.2 冷冻方法

根据降温速率不同将冷冻方法分为三种类型: 快速冷冻法（液氮蒸汽法）、慢速冷冻法（程序冷冻法）和玻璃化冷冻法。目前，国内外许多研究认为采用快速冷冻法和慢速冷冻法两种方法冷冻后，人类精子冷冻复苏率无统计学差异，两种方法冷冻方法均可适用于常规的精子冷冻[9、10、11、12]。另外，通过玻璃化冷冻方法对精子进行冷冻也取得很好的效果。Isachenko V等通过对上游法处理好的精液，用无冷冻保护剂与常规甘油保护剂的慢速冷冻方法比较，发现大体积的玻璃化冷冻方法对精子复苏后精子活力、精子膜完整性均高于普通的冷冻方法[13]。

冷冻过程中与冷冻保护剂接触的时间和温度也会对精子冷冻复苏效果产生影响。冷冻保护剂在温度较高的情况下随着温度上升，毒性也随之增加。因此，在精子冷冻前，一定要注意温度不要过高，室温应该保持在20～30℃。同时，要

注意平衡时间不宜太长。

1.3 复温方法

与精子冷冻过程一样，复苏过程同样会对精子产生损伤。但精子复苏过程到目前为止，还没有得到一个最佳的精液复苏方法。一般认为水浴比在空气中复温速率更快，并且外界温度越高，复温速率越大。现有的复温方法大致包括37℃水浴、15℃水浴、冰水及室温空气中自然复温4种。有些研究认为4种复温方法效果大致相同，也有研究并不认同。有研究认为冷冻精子在40℃条件下复苏比在20℃与37℃之间复苏有更高的精子冷冻复苏率，但两种温度复苏后精子的顶体完整率、DNA一致性，ATP酶含量差异并没有统计学意义[14]。

1.4 精浆比例

人类的精浆成份比较复杂，它的许多功能目前也没完全研究清楚。有研究认为精浆中的前列腺素E可以增加精子内的cAMP浓度[15]，以此来提高精子的运动能力；此外，Henricks等认为胰岛素样生长因子I及其在精子上的受体可以提高精子运动能力，尤其可以提高直线运动速率[16]。但也有研究认为精浆不利于精子受精。通常情况下，在进行宫腔人工授精时，精液常常洗涤以后使用以去除精浆对受精的影响[17]。对于精浆，不同配比的保护剂，保护效力也会不同。有研究显示，与精浆浓度50%相比，75%精浆可能具有更好的保护效果[18]。王学本等通过对含精浆浓度为0%,25%,50%,75%和100%的精子冷冻复苏率进行比较得出结论：一定的精浆浓度可以提高精子的冷冻复苏效果。即对某些不育患者的异常精液进行冷冻处理同时利用高冷冻复苏率的供者精浆置换不育患者精液的精浆可能获得较好的复苏效果[19]。

1.5 优选处理

正常的精子可以耐受一定范围内的冷冻和解冻速率。然而，冷冻保存确实对人精子功能有不良效应，特别是降低精子活力。一般而言，冷冻和解冻后仅约50%的活动精子存活。优化冷冻保存程序可使冷冻损伤降到最低，并且可以由此增加妊娠率[20]。并且，冷冻前精液质量越好（精子浓度、精子活力、形态正常精子百分率），冷冻复苏后精子的活力就越高。因此，为了得到更高比例的活动精子，常常会在冷冻前进行精子的优选处理。这样的精子对冷冻复苏损伤的耐受性更强，精子的冷冻复苏率更高。