研究真核生物启动子结构与功能的方法

研究真核生物启动子结构与功能的方法

研究启动子结构与功能的方法主要有缺失、点突变和足迹法。在分析得到了启动子的功能序列后，还要弄清与之结合的蛋白质及两者间的相互作用。在研究真核生物启动子的结构与功能时，常采用下列方法。

（1）卵细胞系统（oocyte system）该方法是将DNA直接注射人爪蟾卵细胞的细胞核，分析和观察RNA的转录情况。该方法的局限性在于试验条件受卵细胞内条件的限制。可以用来分析：DNA片段的特性，不能用于分析蛋白质因子与DNA间的结合。

（2）转染系统（transfection system）将外源DNA导人转染的细胞并使之表达。表达可分为瞬时表达（transient expression）和整合表达（integrant expression）。由于转录是在细胞内完成的，可以看成是一种体内试验系统。但外源基因又不是细胞所固有的，和细胞固有基因的表达尚有差别。使用多种宿主细胞，可提高该系统的应用价值。

（4）转基因系统（transgenic system）转基因系统将外源基因整合人动物的生殖细胞，使外源基因在部分或全部组织中表达。该系统和转染系统有一些相同的局限性，即外源基因常以多拷贝存在，整合的位置也和内源性基因不同。

（4）体外转录系统（in vitro system）体外转录系统是一种经典的方法。它应用体外转录的方法，结合缺失突变和点突变，来筛选哪些序列是启动子的功能所必需的，哪些序列对启动子的功能有影响，以及哪些辅助因子对启动子或启动子中的某一片段有何种作用。

启动子研究的第一步是确定启动子的位置及长度。主要方法是用缺失试验来确定启动子的上游边界，即当缺失影响转录始时，说明该处就是启动子的上游边界；用缺失试验结合重组试验来确定下游边界。确定了启动子的位置后，可采用点突变来研究每个碱基在启动子中所起的作用。

研究蛋白质辅助因子与DNA（启动子）的相互作用可采用DNase、足迹法、凝胶阻滞法和硫酸二甲酯方法等。